Skip to content

Autoodporność specyficzna względem narządu u myszy, których repertuar komórek T jest kształtowany przez pojedynczy antygenowy peptyd ad

3 miesiące ago

730 words

Tak więc, te myszy umożliwiły śledzenie immunologicznych konsekwencji komórek T CD4 + wybranych do dojrzewania na kompleksie I-AbpEs-5268 eksprymowanym na różnych poziomach w grasicy, bez wpływu tych komórek T na odpowiedź immunologiczną przeciw innym własne lub obce peptydy antygenowe. Poniżej przedstawiamy nieoczekiwane odkrycie, że myszy H3 TKO spontanicznie rozwijają swoistą chorobę autoimmunologiczną obwodowego układu nerwowego z wieloma cechami histopatologicznymi stwierdzonymi w doświadczalnym alergicznym zapaleniu nerwów, model zespołu Guillain-Barré (27, 28). Porównując myszy H3 TKO z liniami opornymi, myszami B2O TKO i nietransgenicznymi miotami (myszy TKO), wykazaliśmy, że rozwój choroby obejmuje samodaktywność komórek T CD4 + do kompleksu I-AbpE2- 52-68, prawdopodobnie spowodowany jego niska ekspresja na komórkach dendrytycznych grasicy odpowiedzialnych za indukcję tolerancji. Metody Myszy. Trzy linie transgenicznych myszy, które ekspresjonują łańcuch IAb kowalencyjnie związany z E (52-68, ale pozbawione endogennego IAb, niezmiennego łańcucha i / lub (2-mikroglobuliny zostały opisane gdzie indziej (22. 24). Wszystkie myszy utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów, a myszy hemizygotyczne dla transgenu zastosowano w niniejszym badaniu. Abs. Następujące mAb zakupiono od PharMingen (San Diego, Kalifornia, USA): skoniugowane z FITC anty-CD8 (53-6,7), FITC (3 anty-CD45R (RA3-6B2), FITC. Anty-CD62L (MEL-14), sprzężone z fikoerytryną (sprzężone z PE) anty-CD4 (RM4-5), skoniugowane z PE anty . TCR (H57-597), PE3 anty-NK1.1 (PK136), PE3 anty-CD90.2 (53-2.1), biotynylowane anty-CD11b (M1 / 70), biotynylowane przeciwciało. TCR (GL3), biotynylowane anty-CD44 (IM7), biotynylowane anty-CD25 (7D4) i PE3 anty-CD11c (HL3). YAe (przeciwciało przeciwko kompleksowi I-Ab3E2-52-68) (29) i Y3P (anty-l-Ab) (30) wyizolowano z supernatantów hodowli komórek hybrydom przy użyciu kolumny białka G, a biotynylowane Abs zostały użyte w eksperymentach barwienia. MAb 33D1, specyficzne dla śledzionowych komórek dendrytycznych, zakupiono od Leinco Technologies Inc. (St. Louis, Missouri, USA). Barwienie błękitem toluidynowym i mikroskopia elektronowa. Nerwy kulszowe zanurzono w 2,5% aldehydie glutarowym w buforze fosforanowym na 14-16 godzin w temperaturze 4 ° C i dodano ponownie w 1% tetratlenku osmu uzupełnionego 1,5% żelazocyjanku potasu w buforze fosforanowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Próbki odwadniano w serii stopniowanych etanolu. Skrawki setynowe zabarwiono błękitem toluidynowym i zbadano pod mikroskopem optycznym. Ultracienkie skrawki barwiono cytrynianem ołowiu i octanem uranu i badano za pomocą mikroskopu elektronowego JEOL 1200 EX (Japan Electron Optics Laboratory, Tokio, Japonia). Immunohistochemia. Świeżo zamrożone skrawki tkanek (o grubości 6. M) przygotowano przy użyciu kriostatu i utrwalono w 100% acetonie. Skrawki wybarwiono panelem skoniugowanych z PE mAb w różnych kombinacjach z biotynylowanymi mAb w temperaturze 4 ° C przez 14-16 godzin. Następnie przemyto je PBS i inkubowano ze sprzężoną ze streptawidyną Oregon Green 488 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Skrawki następnie płukano w PBS i oglądano pod mikroskopem fluorescencyjnym (Nikon Corp., Tokio, Japonia). Zdjęcia fluorescencyjne i fazowo-kontrastowe wykonano przy użyciu HCC-3800, kolorowej kamery 3-CCD firmy Flovel Co. Ltd. (Tokio, Japonia). Obrazy zostały przetworzone przy użyciu programu Adobe Photoshop 5.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, Kalifornia, USA). W celu oceny infiltracji makrofagów CD11b + w nerwy kulszowe, zamrożone skrawki najpierw inkubowano z biotynylowanym mAb anty-CDllb, a następnie poddawano reakcji z peroksydazą-awidyną. Skrawki wizualizowano w świeżej mieszaninie 0,02% 3,3 -diaminobenzydyny w buforze Tris-HCl (0,005 M, pH 7,6). Przygotowanie komórek i cytometria przepływowa. Śledzionkowe i grasicze komórki dendrytyczne przygotowano ze śledziony lub tymianek, które traktowano kolagenazą D (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA), a następnie odwirowano w gęstej BSA, aby zapewnić populację o niskiej gęstości i wybarwiono YAe w połączeniu z FITC. Przeciwciała monoklonalne -33D1 lub FITCa anty-CD8 i PEc anty-CD11c, odpowiednio. Ekspresję kompleksu I-Ab . E (52-68 na śledzionowych komórkach B oceniono przez barwienie komórek śledziony za pomocą mAb anty-CD45R FITC. i biotynylowanego YAe, a następnie streptawidynę-PE. Ekspresję CD44, CD62L lub CD25 na powierzchni komórki na komórkach T CD4 + analizowano przez wybarwianie komórek śledziony odpowiednimi Abs. Analizy przeprowadzono na cytometrze przepływowym FACScan przy użyciu oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA). Dystrybucja limfocytów T CD4 + i wytwarzanie cytokin. Szczepionkowe komórki T CD4 + przygotowano z myszy H3 TKO dotkniętych chorobą, stosując Dynabeads M-450 powleczone przeciwciałem przeciw mysiemu CD4 i DETACHaBEAD (oba z Dynal Biotech, Oslo, Norwegia)
[podobne: dieta dukana przepisy faza 1, fit med, odżywki na mase mięśniową ]
[patrz też: fitomed krem nawilżający tradycyjny, green ways jęczmień, fit med salon ]