Skip to content

Dowód, że białko-5 wiążące IGF działa jako czynnik wzrostu ad

2 miesiące ago

746 words

Na podstawie tych wyników i ustaleń, że względne stężenie IGFBP-5 w kondycjonowanej pożywce ludzkich osteoblastów jest o rząd wielkości wyższe niż IGF (26), zaproponowaliśmy hipotezę, że IGFBP-5 funkcjonuje jako wzrost czynnik i działa częściowo poprzez mechanizm niezależny od IGF. W niniejszym badaniu ocenialiśmy zatem in vitro i in vivo działanie IGFBP-5 na parametry tworzenia kości przy użyciu myszy z knockoutem IGF-I (KO) jako modelu. Metody: -MEM, podłoże Ham F12 i DMEM zakupiono w Life Technologies Inc. (Gaithersburg, Maryland, USA) i Mediatech Inc. (Herndon, Virginia, USA). Suplementowane FBS i Fe surowica bydlęca (CS) pochodziła z Hyclone (Logan, Utah, USA). BSA i fosforan paranitrofenylu zakupiono od Fluka (Buchs, Szwajcaria). Wszystkie inne chemikalia były klasy enzymatycznej i zakupione od Fisher Scientific (Tustin, Kalifornia, USA) lub Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Rekombinowany ludzki IGF-I był prezentem od Upjohn / Pharmacia (Sztokholm, Szwecja). Rekombinowany ludzki IGFBP-5 eksprymowano w Escherichia coli i oczyszczono jak opisano wcześniej (7). Rekombinowany ludzki IGFBP-5 był prezentem od K. Lang (Roche Diagnostics GmbH, Penzeberg, Niemcy). Rekombinowany ludzki IGFBP-4 eksprymowano w E. coli i oczyszczono jak opisano wcześniej (27). Ani preparaty IGFBP-5, ani IGFBP-4 stosowane w tych badaniach nie zawierały wykrywalnych poziomów zarówno IGF-I, jak i IGF-II. Hodowla komórek Osteoblastów Wykorzystane komórki Osteoblast zostały wyizolowane przez trawienie kolagenazą z kalwarii nowonarodzonych myszy C3H / HeJ, jak opisano wcześniej (28). Uwolnione komórki przemyto DMEM + 10% surowicą cielęcą i wysiano na te same podłoża w 10 cm płytkach. Komórki w pasażu drugim wykorzystano do badań proliferacji komórek i fosfatazy alkalicznej (ALP). Klony komórek klonalnych IGF-I KO Osteoblasty izolowano z kalandrii noworodków IGF-I KO i myszy typu dzikiego i hodowano w mieszaninie 1: DMEM i pożywki Ham F12 z 10% FCS. Komórki hodowano do 50. 80% konfluencji i dzielono 1: 3 dla 26. 32 pasaży, podczas których komórki spontanicznie unieśmiertelniono. Następnie komórki wysiano w gęstościach klonalnych na 10-cm szalkach hodowlanych, a poszczególne klony zebrano za pomocą butli do klonowania szkła. Klony, które namnożyły się dobrze, ekspandowano i komórki przechowywano kriogenicznie. Komórki do doświadczeń rozmrożono i hodowano kilka pasaży w P-MEM z 10% CS, a następnie stosowano do doświadczeń in vitro. 80% konfluentnych hodowli inkubowano w pożywce bez surowicy przez 48 godzin, a pożywki z osteoblastów pochodzących od myszy typu dzikiego i IGF-I KO stosowano do pomiaru poziomów IGF-I i IGF-II. Myszy IGF-I KO Hodowane myszy heterozygotyczne pod względem allelu IGF-I KO zostały dostarczone przez A. Efstratiadis (Columbia University, New York, New York, USA). Szczenięta IGF-I-null zidentyfikowano przez charakterystyczny mały rozmiar przy urodzeniu i brak wzrostu po urodzeniu (5), jak również przez analizę PCR z zastosowaniem startera do przodu IGF-I (5a-CCACAGGCTATGGCTCCAGCATTC-3 .), IGF-I primer odwrotny (5a-GTCAGTGTGGCGCTCGGCAC-3a) i primer neo reverse (5a-ATCCATCTTGTTCAATGGCCGATCCC-3a) dający produkt o wielkości 450 par zasad dla rozerwanego genu IGF-I i produkt o wielkości 160 par zasad dla genu typu dzikiego. Mioty z heterozygotami były genotypowane i wykorzystywane do hodowli, a zwierzęta dzikie ze ściółki były używane jako zwierzęta kontrolne w tym badaniu. Eksperymenty in vitro Aktywność biologiczną preparatów IGFBP-5 ustalono na podstawie proliferacji komórek, stosując test alamarBlue, miarę liczby komórek (AccuMed International Inc., Westlake, Ohio, USA). W skrócie, komórki wysiano na 96-studzienkowe płytki przy 2000 komórek na studzienkę w 50 ul DMEM lub a-MEM zawierającym 0,1% CS i 0,1% BSA. Dwadzieścia cztery godziny później, pożywki usunięto, warstwy komórek przepłukano PBS i 100 ul 10 ng / ml IGF-I lub różne stężenia (0,1. 100 ng / ml) IGFBP-5 w DMEM lub. -MEM zawierający 0,1% BSA dodano do każdej studzienki. Podłoże zostało zastąpione 48 godzin później 100 .l 10% alamarBlue rozcieńczonego w DMEM wolnym od czerwieni fenolowej lub (3-MEM. Fluorescencję oznaczono 4 godziny później przy użyciu czytnika płytek fluorescencyjnych (Fluorolite 1000, Dynex Technologies Inc., Chantilly, Virginia, USA). W celu oceny specyficznej aktywności ALP, komórki traktowano jak tu już opisano dla testu alamarBlue, ale inkubowano 72 godziny po dodaniu czynników. Pod koniec inkubacji pożywki usunięto, a warstwy komórek przepłukano PBS i ekstrahowano 0,1 ml 0,01% roztworu Triton X-100 w 25 mmol / l buforze NaHCO3 (pH 7,5) (29). Eksperymenty in vivo: myszy C3H / HeJ zakupione w The Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA) i myszy IGO-I KO umieszczono w kontrolowanym środowisku z 12-godzinnymi cyklami światło / ciemność w temperaturze 70 ° F z pożywieniem i wodą ad libitum
[patrz też: niedobór witaminy d u dorosłych objawy, zapalenie woreczka łzowego, fitomed krem nawilżający tradycyjny ]
[hasła pokrewne: green ways jęczmień, fit med salon, fitmed ]