Skip to content

Dowód, że białko-5 wiążące IGF działa jako czynnik wzrostu czesc 4

3 miesiące ago

263 words

Aktywność ALP w ekstraktach z kości wyrażono jako milijednostki na miligram białka lub w milijednostkach na miligram suchej masy kości. Całkowite poziomy białka. Stężenie białka oznaczono za pomocą testu Bradforda z użyciem komercyjnego zestawu (Bio-Rad Laboratories Inc.). Analiza statystyczna Analiza statystyczna danych została przeprowadzona za pomocą testu t lub metody najmniej znaczących różnic ochronnych Fishera (test post hoc) dla wielokrotnych porównań w jednokierunkowej ANOVA, stosownie do przypadku. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Wyniki Poziomy IGF-I i IGF-II w kondycjonowanych pożywkach i próbkach surowicy Jak oczekiwano, poziomy IGF-I w surowicy i kondycjonowanej pożywce osteoblastów myszy IGO-I KO były niewykrywalne. Surowica i kondycjonowana pożywka osteoblastów z 7- do 9-tygodniowych myszy z dzikim rodzajem miotu zawierała odpowiednio około 300 ng / ml i ng / ml IGF-I. Wiadomo, że zmiana rozwojowa z ekspresji IGF-II na IGF-I występuje u gryzoni we wczesnym okresie życia po urodzeniu. Aby określić, czy dorosła mysia surowica zawiera IGF-II i osteoblasty pochodzące od myszy po urodzeniu wytwarzają IGF-II, mierzyliśmy również poziomy IGF-II w surowicy i kondycjonowanej pożywce osteoblastów pochodzących od IGF-I KO i odpowiednich myszy typu dzikiego z rodzaju miotu. Figura pokazuje, że surowica z 7-dniowych myszy typu dzikiego wypierała znacznik IGF-II równolegle ze standardem IGF-II stosowanym w tym badaniu. Ilość IGF-II zawartego w surowicy 7-dniowych myszy typu dzikiego oszacowano na 637 ng / ml. Przeciwnie, surowica od myszy dorosłych IGF-I KO (56-dniowych) lub ich odpowiedników myszy typu dzikiego z miotu nie zawierała wykrywalnych poziomów IGF-II mierzonych za pomocą RIA (<10 ng / ml). Ponadto poziomy IGF-II w kondycjonowanej pożywce osteoblastów pochodzących od myszy IGO-I KO lub ich odpowiednich myszy typu dzikiego były poniżej wykrywalnego limitu (<50 pg / ml). Rycina 1Zastosowanie znacznika IGF-II z antyserum IGF-II. Związane z wolnymi stosunkami (B / Bo) na osi y reprezentują względne poziomy znakowanego radiologicznie znacznika związanego z antyserum zi bez konkurenta. Konkurencja między znacznikiem [125I] IGF-II i oczyszczonym rekombinowanym ludzkim IGF-II (puste kółka), pulą IGF od 7-dniowych myszy typu dzikiego (wypełnione kwadraty), pulą IGF z 56-dniowego typu dzikiego (wypełnione trójkąty) lub myszy IGO z IGF-I (puste kwadraty) i puli IGF z kondycjonowanej pożywki osteoblastów pochodzących od myszy typu dzikiego (z wypełnionym kołem) lub z nokautem IGF-I (×). Łącznie 50 ul rozcieńczonej 1: 5 surowicy lub 60 x stężonego kondycjonowanego pożywki nałożono na Bio-Gel P-10, a IGFB oddzielono od IGFBP za pomocą Bio-Spin w 1M kwasie octowym. Pula IGF została zneutralizowana równą objętością 1,2 M zasady Tris przed RIA. W przypadku próbek surowicy 10, 20 lub 40 .l puli IGF poddano RIA w ostatecznym rozcieńczeniu 1: 1500; 1: 750; i odpowiednio 1: 375. W przypadku próbek kondycjonowanych pożywek 50 .l puli IGF poddano RIA przy końcowym stężeniu x kondycjonowanej pożywki. Eksperymenty in vitro Aby zbadać, czy IGFBP-5 pośredniczy częściowo w działaniu mechanizmu niezależnego od IGF-I, porównaliśmy biologiczne efekty IGFBP-5 lub IGF-I na proliferację komórek i aktywność ALP przy użyciu osteoblastów mysich o kalwarii pochodzących z dzikich zwierząt. myszy typu i IGF-I KO w hodowlach bez surowicy. Leczenie IGFBP-5 zwiększało proliferację komórek i aktywność ALP w sposób zależny od dawki we wczesnych pasażach komórek C3-C-calvaria oraz w komórkach IGF-I-KO i typu dzikiego w testowanych liniach komórkowych Calvaria (Tabela 1, Figura 2). IGFBP-5 w stężeniu ng / ml i wyższe stężenie zwiększyło proliferację komórek o 20. 40% we wszystkich grupach komórkowych. IGFBP-5 zwiększał aktywność ALP w komórkach KO IGF-I 10 ~ 40%, podobnie jak w przypadku linii komórek typu dzikiego i wczesnego pasażowania kultur C3H osteoblastów. IGF-I w stężeniu 10 ng / ml, zgodnie z oczekiwaniami, znacząco zwiększył proliferację komórek o 30. 40% i zwiększoną aktywność ALP o 20. 30% w osteoblastach pochodzących od myszy typu dzikiego i myszy IGO z IGF-I. Figura 2 Wpływ IGFBP-5 na proliferację komórek i aktywność ALP we wczesnych pasażach C3H mysiego osteoblastów kostnych (MOB) oraz w liniach komórkowych typu dzikiego (WT) i nokaut IGF-I (KO-1 i KO-2). Komórki wysiewano przy 2000 komórek na studzienkę i inkubowano w pożywce zawierającej 0,1% CS i 0,1% BSA. Po 24 godzinach pożywki zostały całkowicie usunięte i zastąpione 100 ng / ml IGFBP-5 w pożywce zawierającej 0,1% BSA (wolne od surowicy). Po dodatkowych 48 lub 72 godzinach inkubacji oznaczono proliferację komórek za pomocą testu AlamarBlue i aktywność ALP komórek, jak opisano w Methods. Wartości są średnie. SEM (n = 8). Różnice w stosunku do kontroli określono przez analizę wariancji. AP <0,05, BP <0,01 i CP <0,001. Tabela Wpływ IGFBP-5 na proliferację komórek i aktywność ALP w komórkach klonu typu dzikiego i klonu IGF-I KO Chociaż poziom IGF-II był niewykrywalny w kondycjonowanej pożywce osteoblastów pochodzących od myszy IGO IGO-I, IGF-II może być wytwarzany w niewykrywalnej ilości, która była odpowiednia dla działania IGFBP-5 zależnego od IGF [przypisy: zapalenie woreczka łzowego, fundacja stwardnienie rozsiane, chomik syryjski ile żyje ] [patrz też: odżywki na mase mięśniową, jęczmień green ways, kotlety mielone bez jajka ]