Skip to content

FOXP3 jest nowym represorem transkrypcyjnym dla onkogenu SKP2 raka sutka ad 5

2 tygodnie ago

140 words

Aby uzasadnić, że inaktywacja FOXP3 jest pierwotnym zdarzeniem prowadzącym do nadekspresji SKP2, transdukowaliśmy wczesny pasaż normalnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) lentiwirusowym wektorem kodującym siRNA swoisty dla FOXP3 lub kontrolnego wektora lentiwirusowego. Niezniszczone komórki zostały wyeliminowane przez blastycydynę. Jak pokazano na Figurze 5A, transdukcja siRNA FOXP3 spowodowała ponad 100-krotne zmniejszenie transkryptu FOXP3. Odpowiadając temu zaobserwowano 4-krotny wzrost transkryptów SKP2 (Figura 5B). Dane te pokazują, że w HMECs FOXP3 jest ważnym regulatorem dla genu SKP2. Figura 5 Wyciszanie FOXP3 prowadziło do regulacji w górę SKP2 w pierwotnym HMEC. FOXP3 został wyciszony w HMEC przy użyciu siRNA. Transkrypty FOXP3 i SKP2 oznaczano ilościowo metodą PCR w czasie rzeczywistym. Wejścia RNA znormalizowano względem genu metabolizmu podstawowego GAPDH. Przedstawione dane to środki. SEM względnych poziomów FOXP3 i reprezentujących 3 niezależne eksperymenty (P <0,01, test Student. St). W A, wektor kontrolny określono jako 1,0; w B wyciszone komórki określono jako 1,0. Przedstawione dane to środki. SD z trzech powtórzeń i reprezentują 3 niezależne eksperymenty. Aby zidentyfikować cele FOXP3 w złośliwych komórkach nabłonkowych sutka, wytworzyliśmy linie komórkowe z indukowalną ekspresją FOXP3 z MCF-7, linii komórkowej ludzkiego raka sutka, która nie nadeksprymuje onkogenu HER2, jak przedstawiono na Figurze 6, górny panel. Przeanalizowaliśmy ekspresję SKP2 w różnych punktach czasowych po hodowli komórek pod nieobecność deoksycykliny, która indukowała ekspresję FOXP3 (7). Poziomy SKP2 oznaczono ilościowo metodą PCR w czasie rzeczywistym i porównano z kontrolnymi liniami komórkowymi wyrażającymi GFP, ale nie FOXP3 w tych samych warunkach. Względne poziomy transkryptów SKP2 kontrolnych linii komórkowych i komórek wyrażających FOXP3 w różnych czasach są przedstawione na Figurze 6, dolny panel. Używając poziomów nieindukowanych komórek jako odniesień, zaobserwowaliśmy prawie 4-krotne zmniejszenie mRNA SKP2 w ciągu 24 godzin po usunięciu deoksycykliny w transfektantach FOXP3. Po 48 godzinach zaobserwowano ponad 8-krotne zmniejszenie. Nie obserwowano redukcji transkryptu SKP2 w kontrolnych liniach komórkowych hodowanych w tych samych warunkach. Dane te wykazują szybką represję transkryptów SKP2 po indukcji FOXP3. Figura 6 Zaskakująca ekspresja FOXP3 w komórkach raka piersi TetOff gwałtownie obniżyła ekspresję SKP2. Górny panel pokazuje schemat przedstawiający strukturę promotora w wektorze pBI-EGFP. Dwukierunkowy promotor Pbi-1 reagował na białka regulatorowe tTA w systemie TetOff. Pbi-1 zawiera element reagujący na tetracyklinę (TRE), który jest pomiędzy dwoma identycznymi minimalnymi promotorami CMV (PminCMV). EGFP znajduje się po jednej stronie, podczas gdy cDNA ludzkiego FOXP3 wstawiono w miejsca PvuII / NheI w przeciwnym kierunku. Użyto również wektora kontrolnego z GFP, ale bez cDNA FOXP3. Niższy panel przedstawia kinetykę represji SKP2 przez FOXP3. FOXP3 indukowano przez wycofanie deoksycykliny w pożywce. Poziomy transkryptu najpierw znormalizowano pod kątem wprowadzania RNA za pomocą GAPDH, a następnie porównano z poziomami obserwowanymi w kontrolnych liniach komórkowych, zdefiniowanych jako 1,0. Donoszono, że locus FOXP3 jest często inaktywowany w większości, choć nie we wszystkich, tkankach raka sutka u ludzi. Z drugiej strony, SKP2 ulega nadmiernej ekspresji w prawie 50% próbek raka piersi (12-15). Jeśli utrata FOXP3 przyczynia się do ekspresji SKP2, można oczekiwać zwiększonej liczby próbek SKP2 + wśród FOXP3. guzy. Aby rozwiązać ten problem, niezależnie barwiliśmy i ocenialiśmy w sposób podwójnie ślepy 206 próbek raka sutka w mikromacierzy tkankowej w celu ich ekspresji SKP2 i FOXP3. Jak pokazano na rysunku 7, wśród próbek FOXP3 +, mniej niż 30% komórek wyrażało SKP2. W przeciwieństwie do ponad 56% FOXP3. próbki wykazały nadekspresję SKP2. Analiza statystyczna wykazała, że różnica była bardzo znacząca (P = 0,0016). Figura 7 Znaczące zmniejszenie szybkości regulacji w górę SKP2 w próbkach raka piersi FOXP3 +. Próbki mikromacierzy z tkanki ludzkiego raka sutka barwiono przeciwciałem anty-FOXP3 lub przeciwciałem anty-SKP2. Próbki były oceniane w sposób podwójnie ślepy. Górne panele pokazują wzorce wybarwiania FOXP3 lub SKP2 w 2 reprezentatywnych przypadkach. Oryginalne powiększenie, × 60. Podsumowanie danych z 206 niezależnych przypadków przedstawiono w dolnym panelu. Pokazano wartości P dla testów. 2. Ektopowa ekspresja SKP2 omijająca hamowanie wzrostu za pośrednictwem FOXP3 w linii komórkowej raka sutka HER2lo. Nasze poprzednie badania wykazały, że FOXP3 może hamować wzrost zarówno linii komórek nowotworowych ERBB2hi, jak i ERBB210 [przypisy: dieta dukana przepisy faza 1, podkład match perfection, fit med salon ] [patrz też: warta ubezpieczenie turystyczne, kotlety mielone bez jajka, sennik pocałunek w policzek ]