Skip to content

FOXP3 jest nowym represorem transkrypcyjnym dla onkogenu SKP2 raka sutka cd

1 miesiąc ago

692 words

Stopień redukcji korelował z poziomami transkrypcji Foxp3. Natomiast nie wykryto zmian poziomów mRNA p27. Ponieważ Skp2 reguluje degradację p27, zbadaliśmy również poziomy tych 2 białek w transfektantach Foxp3-V5. Jak pokazano na rysunku 2B, transfekcja Foxp3 znacznie zredukowała Skp2. Odpowiednio, p27 był znacząco zwiększony w transfektantu Foxp3-V5. Aby ustalić, czy wzrost p27 był spowodowany szybszą degradacją, potraktowaliśmy komórki TSA transfekowane wektorem lub Foxp3-V5a cykloheksymidem i mierzyliśmy poziomy p27 po 0, 1, 2 i 4 godzinach po traktowaniu metodą Western blot. Jak pokazano na Figurze 2C, p27 ulegało degradacji z dużo większą szybkością w transfekowanych wektorowo komórkach TSA. Zgodnie z tym poglądem zaobserwowaliśmy zmniejszoną ubikwitynację p27 w komórkach transfekowanych Foxp3 (rysunek 2D). Rysunek 2Foxp3 tłumi transkrypcję Skp2. (A) Transfekcja Foxp3-V5 do komórek TSA stłumiła ekspresję genu Skp2. Poziomy mRNA dla Foxp3, Skp2 i p27 mierzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym dla komórek kontrolnych wektora, poliklonalnych transfektantów Foxp3-V5 (CL30) i 2 stabilnych klonów transfektantów Foxp3-V5, CL302 i CL305. Przedstawione dane są względnymi ilościami transkryptów po normalizacji względem ilości całkowitego RNA w oparciu o poziomy mRNA Hprt. Środki grupy wektorów są sztucznie definiowane jako 1,0. Przedstawione dane to środki. SD z 3 niezależnych eksperymentów. (B) Foxp3 zmniejsza Skp2 z odpowiednim wzrostem w p27. Lizaty Foxp3-V5 lub linie komórek TSA transfekowane wektorem analizowano metodą Western blot stosując przeciwciała SKP2, p27, P-aktyny i anty-V5 (które rozpoznają znakowane V5 Foxp3). (C) Foxp3 zwiększona stabilność p27. Transfektanty wektorowe lub Foxp3-V5 traktowano cykloheksymidem (CHX, 100 | jM) we wskazanych odstępach czasu. Komórki zebrano i poziomy białka p27 wykryto metodą Western blot. Górny panel pokazuje reprezentatywne eksperymenty, podczas gdy dolny panel pokazuje rozpad p27, używając czasu 0 jako 1,0. Równoważność obciążenia białkiem oceniano przez ekspresję p-aktyny. Względną intensywność prążków zmierzono względem odpowiednich pasm P-aktyny za pomocą oprogramowania BandScan (wersja 4.3, Glyco). (D) Polubikwitynacja p27 w wektorze lub transfektantach Foxp3. Linie komórkowe TSA transfekowane wektorami lub Foxp3-V5a albo nie traktowano albo traktowano inhibitorem proteasomu MG132 (40 | jM) przez 3 godziny. Równą porcję lizatów komórkowych poddano immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-p27. Osady oddzielono za pomocą SDS-PAGE i przeniesiono na błonę nitrocelulozową, które następnie autoklawowano w wodzie przez 30 minut i osuszono sprzężonym z HRP przeciwciałem przeciw poliubikwitynie Ub P4D1 (33). Aby dodatkowo potwierdzić, że obniżenie Skp2 przez Foxp3 wystąpiło na poziomie transkrypcji, sklonowaliśmy region 2,0 kb powyżej mysiego genu Skp2 do wektora reporterowego lucyferazy pGL2 i przetestowaliśmy wpływ Foxp3 na aktywność tego promotora w teście lucyferazy. . Jak pokazano na Figurze 3A, Foxp3 zasadniczo reprymował aktywność promotora genu Skp2. Rysunek 3 Wiązanie Foxp3 z Skp2 jest ważne dla represji transkrypcji. (A) Foxp3 tłumi aktywność promotora Skp2 myszy. Albo cDNA Foxp3 albo pusty wektor przejściowo kotransfekowano wektorem reporterowym w różnych proporcjach zilustrowanych na figurze. Komórki transfekowano albo kontrolą wektorową albo Foxp3 (1 .g / studzienkę) w połączeniu z reporterem lucyferazy napędzanym przez 5 .l. regiony promotorowe genu Skp2 (0,2 .g, 0,4 .g i 1,0 .g na studzienkę). Czterdzieści osiem godzin później lizaty komórkowe zebrano i zmierzono dla aktywności lucyferazy. Aktywność lucyferazy z komórek transfekowanych wektorem podstawowym pGL2 została arbitralnie zdefiniowana jako 1,0. Przedstawione dane to środki. SD trzech powtórzeń i powtórzono je co najmniej 3 razy. (B) Górny panel przedstawia 5. region genu Skp2. Dolny panel pokazuje ilość DNA wytrąconego przez mAb anty-V5 po odjęciu minutowej części wytrąconej przez kontrolę IgG. Przedstawione dane stanowią ułamek całkowitego genomowego DNA wyizolowanego z tej samej liczby komórek. (C) Delecja z 2 miejsc wiązania Foxp3 w regionie promotora Skp2 zapobiegła supresji z udziałem FOXP3. Usunięte sekwencje to mutacja A: ACTAAACCAATATTCTAAT i mut B: TAAAAATAAACCATC. Aktywność promotora zmierzono w linii ludzkiego raka piersi T47D. Analiza promotora Skp2 ujawniła 4 potencjalne miejsca wiązania w regionie promotora 2 kb (Figura 3B). Przeprowadziliśmy immunoprecypitację chromatyny (ChIP), aby określić, czy Foxp3 wiąże się z promotorem
[więcej w: portius krosno godziny otwarcia, fit med salon, fit med ]
[przypisy: fit med salon, fitmed, fit med ]