Skip to content

FOXP3 jest nowym represorem transkrypcyjnym dla onkogenu SKP2 raka sutka czesc 4

2 miesiące ago

685 words

Preparaty jądrowe z komórek transfekowanych Foxp3 zostały utrwalone paraformaldehydem. Po sonikacji genomowy DNA związany z Foxp3 poddano immunoprecypitacji i oznaczono ilościowo metodą PCR w czasie rzeczywistym. Aby uniknąć artefaktów związanych z amplifikacją różnicową, porównaliśmy ilość wytrąconego DNA z całkowitym wkładem genomowego DNA, amplifikowanym przez te same pary starterów. Ponadto odjęto niewielką ilość DNA wytrąconego przez kontrolę IgG. Jak pokazano na Figurze 3B, startery odpowiadające regionom a-0,8-kb i a-1,2-kb dały znaczące ilości produktu, który wynosił 5% . 6% wejściowego DNA. W przeciwieństwie do tych odpowiadających obszarowi a-2,2- lub + 0,6-kb nie ma określonego sygnału. Aby określić znaczenie interakcji, ustaliliśmy, czy delecja miejsca wiążącego zaburzyła represję aktywności promotora przez Foxp3. Jak pokazano na Figurze 3C, podczas gdy promotor WT był represjonowany przez Foxp3, delecja jednej z miejsc wyeliminowała represję. Tak więc dane przedstawione w tej sekcji pokazują, że wiązanie Foxp3 do konkretnych miejsc w promotorze Skp2 jest niezbędne do represji Foxp3 ekspresji Skp2. Ekspresja Foxp3 spowodowała poliploidalność linii komórkowych raka sutka. Jedną z jasno zdefiniowanych funkcji Skp2 jest regulacja poziomów p27 w fazie G2 / M w cyklu komórkowym (4, 9). Jako przejaw wadliwego przejścia G2 / M, komórki wątroby u myszy z niedoborem Skp2 wykazały drastycznie zwiększoną poliploidalność (8, 9). Dlatego też odsetek komórek z poliploidalnością może być użyty jako wartościowy parametr funkcji Skp2. Wybraliśmy transfekowaną Foxp3 linię komórkową TSA o umiarkowanych poziomach białka Foxp3-V5 w celu zbadania wpływu ekspresji Foxp3 (Figura 4A) na komórkową funkcję Skp2 w celu uniknięcia możliwych artefaktów związanych z nadekspresją. Real-time PCR ujawnił, że poziomy transkryptów Foxp3 w stabilnych transfektantach są około 4,5-krotnie wyższe od izolatów nabłonka sutka ex vivo po normalizacji względem transkryptów Ck19 (Figura 4A). Ponieważ nie wszystkie komórki nabłonka gruczołu sutkowego eksprymują Foxp3, różnica między transfektantami a poziomami fizjologicznymi normalnych komórek prawdopodobnie będzie jeszcze mniejsza. Jak pokazano na Figurze 4B, tylko nieco więcej niż 50% transfektantów miało widoczne poziomy białka fuzyjnego Foxp3-V5. To pozwoliło nam porównać zawartość DNA w podgrupach Foxp3hi i Foxp3lo z tej samej hodowli, oprócz porównania ich z transfektantami wektora kontrolnego. Jak pokazano na Figurze 4B, mniej niż 1% komórek trans kontrolnych wektora a trans wykazywało> 4C zawartość DNA, zgodnie z oczekiwaniami. Ten sam wzór zaobserwowano w podzbiorze Foxp3lo z transfektantów Foxp3. Przeciwnie, około 25% komórek Foxp3hi miało> 4C zawartości DNA. Aby określić, czy poliploidię można przypisać regulacjom w dół Skp2, ektopowo wyrażaliśmy cDNA Skp2 w transfektach Foxp3-V5. Jak pokazano na Figurze 4C, ektopowa ekspresja Skp2 znacząco zmniejszyła odsetek komórek z poliploidalną. Dane te pokazują, że poprzez tłumienie ekspresji Skp2, Foxp3 ma bardzo istotny wpływ na progresję cyklu komórkowego. Rycina 4 Polyploidia Foxp3hi, ale nie komórki myszy z rakiem sutka Foxp350. (A) Skromna ekspresja Foxp3-V5 w transfektantu Foxp3 w porównaniu z nietransfekowanymi komórkami rodzicielskimi lub komórkami transfekowanymi kontrolnym wektorem. Dane pokazane w górnym panelu to histogramy przedstawiające poziomy białka Foxp3-V5, podczas gdy te w dolnym panelu pokazują poziomy mRNA FoxP3 w Foxp3-V5- lub transfekowane vecotr TSA lub LCM przechwycone mysie komórki nabłonkowe sutka (MME), mierzone przez ilościowy PCR w czasie rzeczywistym. (B) Ekspresja Foxp3 powodowała poliploidię. Lewy panel pokazuje poziom białka fuzyjnego Foxp3-V5 w kontroli wektorowej (u góry) lub komórki TSA transfekowane Foxp3 (u dołu), podczas gdy prawy panel pokazuje zawartość DNA wektora kontrolnego (u góry), Foxp3hi (w środku) i komórki Foxp3lo (Dolny). (C) Ektopowa ekspresja Skp2 złagodzonej poliploidii indukowanej przez Foxp3. Wektor (i, ii) lub Foxp3 (iii, iv) transfektantów TSA transfekowano albo kontrolą wektorową albo Skp2. Po usunięciu nietransfekowanych komórek za pomocą blastycydyny, transfektanty utrwalono buforem Cytofix / Cytoperm (BD) i testowano zawartość DNA przy użyciu 7-AAD. Reprezentatywne profile są pokazane w lewym i środkowym panelu, a sumaryczne dane z 3 niezależnych eksperymentów są pokazane w prawym panelu. * P <0,05. Ekspresja Foxp3 i SKP2 w prawidłowych i złośliwych komórkach nabłonka ludzkiego sutka. Kluczową kwestią jest to, czy ekspresja Foxp3 reguluje SKP2 w ludzkich komórkach nabłonkowych sutka [przypisy: przepisy w diecie dukana, fit med, leczenie kanałowe białystok ] [patrz też: chomik syryjski ile żyje, portius krosno godziny otwarcia, odżywki na mase mięśniową ]