Skip to content

Inaktywacja aktywowana płytkami in vitro trombiny jest niezależna od vWF podczas tworzenia skrzepliny w modelu urazu laserowego ad 7

2 tygodnie ago

862 words

Charakterystyka vWF. /. i FcR /. myszy zostały wcześniej opisane (9). We wszystkich eksperymentach na myszach w przedstawionych tutaj badaniach, płytki dawcy uzyskano od myszy o tym samym genotypie co mysz biorca. Ośrodek ds. Opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w Beth Israel Deaconess Medical Center zatwierdził wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentalne. Przeciwciała i odczynniki. Szczurze przeciwciało anty-mysie CD41 (klon MWReg30) i szczurze przeciwciało przeciwko mysiej selektynie P (klon RB 40.34) pochodziły od BD Biosciences. Pharmingen. Mysie przeciwciało przeciw ludzkiemu fibrynowemu II ((klon NYBT2G1) pochodziło z Accurate. Fragmenty Fab z przeciwciała anty-CD41 wytworzono przy użyciu zestawu do przygotowywania ImmunoPure Fab z Pierce, a następnie skoniugowano z Alexa Fluor 647 zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). Przeciwciało anty-fibrynę skoniugowano z Alexa Fluor 488. Lepirudynę (Berlex) podawano in vivo co 30 minut za pomocą cewnika szyjnego w dawce 8 U / g myszy. Przygotowanie i wstępne traktowanie przemytych płytek krwi. Krew pobrano od myszy w roztworze cytrynianu (ACD: 85 mM cytrynian trisodowy, 67 mM kwas cytrynowy, 111,5 mM glukozy, pH 4,5) w obecności 0,5 mM prostacykliny (PGI2, Calbiochem-Novabiochem) i 0,02 U / ml apyrazy ( Sigma-Aldrich). Płytki krwi oddzielono od świeżo pobranej krwi przez odwirowanie i przemyto dwukrotnie buforem CGS (13 mM cytrynian trisodowy, 30 mM dekstroza i 120 mM NaCl, pH 7,0) w obecności 0,04 U / ml apyrazy i 500 nM PGI2, jak opisano wcześniej. (9). Przemyte płytki ponownie zawieszono w stężeniu x 108 płytek / ml w buforze Tyrode (138 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0,36 mM NaH2PO4, 5,5 mM glukozy, 1,8 mM CaCl2 i 0,4 mM MgCl2, pH 7,4) zawierający 0,2% BSA (Sigma-Aldrich). Płytki krwi inkubowano z .g / ml czerwono-pomarańczowej kalceiny AM (Molecular Probes, Invitrogen) lub 3 .M fura-2 / AM (Molecular Probes, Invitrogen) pod nieobecność lub w obecności 50 .M BAPTA-AM (Calbiochem -Novabiochem) przez 40 minut w ciemności w 37 ° C, odwirowano i ponownie zawieszono w buforze Tyrode przy 100 x 107 płytek / ml przed wstrzyknięciem myszom biorcy. Cytometrii przepływowej. Płytki spoczynkowe lub aktywowane trombiną (0,1 U / ml) (1 x 106 komórek) inkubowano z 2,5 ug przeciwciała znakowanego FITC skierowanego przeciwko mysiej P-selektynie (klon RB40.34) przez 5 minut. Ekspresję P-selektyny na powierzchni spoczynkowych i aktywowanych płytek krwi analizowano za pomocą cytometru przepływowego BD FACSCalibur. Eksperymenty z cytometrią przepływową przeprowadzono na 1,5 × 107 przemytych płytkach krwi. Mikroskopia pod mikroskopem. Wewnątrzobrazową wideomikroskopię mikrokrążenia mięśni Cremastera wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (27). Myszy uprzedzono za pomocą dootrzewnowej ketaminy (125 mg / kg, Abbott), ksylazyny (12,5 mg / kg, Phoenix Pharmaceuticals Inc.) i atropiny (0,25 mg / kg, American Pharmaceutical Partners). Wprowadzono rurkę do tchawicy i utrzymywano mysz w temperaturze 37 ° C na kontrolowanym przez termo kocyk dla gryzoni. Aby utrzymać znieczulenie, Nembutal (Abbott) podawano przez kaniulę umieszczoną w żyle szyjnej. Po nacięciu worka mosznowego jądro i otaczający go mięsień cremastera zostały wyeksponowane na tacę mikroskopową intravital. Preparat Cremastera poddano superfuzji za pomocą kontrolowanego termicznie (36 ° C) i napowietrzonego (95% N2, 5% CO2) roztworu soli buforowanego wodorowęglanem w trakcie doświadczenia. Dane mikropłytek uzyskano za pomocą mikroskopu Olympus AX z obiektywem do zanurzania w wodzie o wymiarach 60 x 0,9 .m. Wcześniej opisany został cyfrowy system mikroskopii fluorescencyjnej z szerokim polem widzenia (27). Cyfrowe obrazy zostały wykonane kamerą Cooke Sensicam CCD w formacie 640 × 480. Uszkodzenie wywołane laserem. Egzogenne płytki znakowane (250 x 106 do 300 x 106) wlewano do krążenia znieczulonej myszy. Podczas stosowania lepirudynę (Berlex) wstrzykiwano przez cewnik szyjny w dawce 8 U / g myszy 5. 15 minut przed urazem wywołanym laserem. Uszkodzenie ścian naczynia indukowano za pomocą systemu laserowego Micropoint (instrumenty fotoniczne), skupionego przez obiektyw mikroskopu, parfokalnego z płaszczyzną ogniskową i wycelowanego w ścianę naczynia, jak opisano wcześniej (12). Zazwyczaj lub 2 impulsy były wymagane do wywołania uszkodzenia ściany naczynia. Ciężkość urazu była porównywalna z ciężkością w modelach urazów laserowych stosowanych przez innych, ale znacznie różniła się od powierzchownych lub umiarkowanych obrażeń używanych przez te same grupy badawcze (28, 29). W eksperymentach z mobilizacją wapnia in vivo, liczba tworzonych zakrzepów była ograniczona do 6 w ciągu 45-minutowego okresu. Wielokrotne zakrzepy badano na pojedynczej myszy, z nowymi zakrzepami uformowanymi przed wcześniejszymi skrzeplinami, aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu skrzeplin generowanych wcześniej u badanego zwierzęcia. Nie obserwowano charakterystycznych tendencji w zakresie wielkości skrzepliny lub składu skrzepliny w sekwencyjnym skrzeplinie generowanej u pojedynczej myszy podczas eksperymentu. Analizę obrazu przeprowadzono za pomocą Slidebook 4.1 (Intelligent Imaging Innovations). Dane fluorescencji rejestrowano cyfrowo z prędkością do 50 klatek na sekundę i analizowano jak opisano wcześniej (27). Kinetykę tworzenia skrzeplin analizowano przez określenie mediany wartości fluorescencji w czasie w około 30 skrzeplinach (30). Statystyka. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu rang Wilcoxona. Dodatkowe materiały Zobacz dodatkowe dane Podziękowania Podziękowania dla Glenn Merrill-Skoloff i Ondrea Graves za fachową pomoc techniczną. Praca ta została wsparta dotacjami z National Institutes of Health na B. Furie i BC Furie. Przypisy Niestandardowe skróty: [Ca2 +] i, wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2 +; GPIb, glikoproteina Ib. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.117: 953. 960 (2007). doi: 10,1172 / JCI30537
[patrz też: przepisy w diecie dukana, młody jęczmień green ways, podkład match perfection ]
[podobne: obliczanie zdolności kredytowej, dieta dukana przepisy faza 1, atopowe zapalenie skory zdjecia ]