Skip to content

Indukcja regulatora sygnału cytokin SOCS3 / CIS3 jako strategia terapeutyczna w leczeniu zapalenia stawów ad 5

3 miesiące ago

359 words

Następnie badaliśmy wpływ CIS3 i dnSTAT3 na wydzielanie prozapalnych cytokin. Poziomy TNF-a, IL-1 (3 i IL-6 analizowano w kondycjonowanej pożywce (CM) fibroblastów maziowych RA zakażonych AxCACIS3-, AxCAdnSTAT3- i AxCALacZ (Figura 2, c i d). Indukowane w surowicy i indukowane TNFa wytwarzanie IL-6 znacznie zmniejszono przez zakażenie AxCACIS3 i AxCAdnSTAT3, ale nie AxCALacZ (kontrola). Jednak TNF-a i IL-1. poziomy nie zostały zmienione przez infekcję AxCACIS3 i AxCAdnSTAT3 (Figura 2c). Dane te sugerują, że szlak JAK / STAT bierze udział w wytwarzaniu IL-6 w fibroblastach w RA, i że adenowirus CIS3 i dnSTAT3 może tłumić nie tylko sygnalizację IL-6, ale także część TNF-a. sygnalizacja. Terapia genowa CIS3 hamuje AIA. Próbowaliśmy tłumić AIA za pomocą adenowirusa niosącego CIS3 lub dnSTAT3. Wykazano, że śródstawowe lub okołostawowe wstrzyknięcie adenowirusa powoduje wydajną i wysoką ekspresję genów egzogennych (21, 22). Konsekwentnie, barwienie in situ dla (3-galu wykazało dyfuzyjne niebieskie zabarwienie w tkankach maziowych i tkankach okołostawowych wstrzykniętych kostek (Figura 3a). Mikroskopia świetlna ujawniła ekspresję transgenu w około 60. 80% komórek maziówkowych w naszych warunkach eksperymentalnych (Figura 3b). Analiza Western blot wykazała, że białko CIS3 wykryto w stawie skokowym 7 dni po wstrzyknięciu 108 PFU AxCACIS3. Jednak po 28 dniach ekspresja CIS3 nie była już wykrywana (dane nie pokazane). Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o przejściowej ekspresji genów adenowirusa (21, 22). Ryc. 3 Wpływ adenowirusów CIS3 i dnSTAT na histopatologię w modelu AIA. Ekspresja in vivo transgenów przez wektory adenowirusowe. (a) Po indukcji AIA, 108 PFU z AxCALacZ wstrzyknięto do stawów skokowych. Następnie, 7 dni później, tylną łapę usunięto i wybarwiono X-galem. (b) Mikroskopowy widok komórek maziowych barwionych X-galem i hematoksyliną (x 400). (c) Reprezentatywne histopatologie stawów skokowych barwione hematoksyliną i eozyną (HE) i Safraniną-O (× 100). Adenowirus lub PBS wstrzyknięto do stawów skokowych w dniu 6, dzień przed drugą immunizacją. Myszy inokulowano wirusem PBS lub LacZ i wirusem CIS3 lub dnSTAT3 do każdego stawu skokowego. Trzydzieści pięć dni po pierwszej immunizacji myszy uśmiercono i poddano badaniu histopatologicznemu. (d i e) Badania histologiczne w sumie 15 myszy dla każdej pary oceniano od 0 do 4, jak opisano w Metodach. * P <0,01. Następnie leczono myszy AIA za pomocą okołostawowego transferu adenowirusowego genów CIS3 i dnSTAT3. Sześć dni po pierwszej immunizacji wstrzyknęliśmy AxCACIS3 lub AxCAdnSTAT3 w lewe stawy kostne i taką samą ilość AxCALacZ lub PBS w prawe stawy skokowe u tych samych myszy. Antygen (mBSA) wstrzykiwano w dniu 7 iw dniu 21. Myszy uśmiercono 35 dni po pierwszej immunizacji i przeprowadzono badanie histologiczne. Jak pokazano na Fig. 3, cis, CIS3 i STAT3 tłumiły infiltrację komórek jednojądrzastych i tworzenie się łuszczki. Barwienie safraniną O ujawniło, że chrząstka była prawie całkowicie zniszczona u myszy, którym wstrzyknięto AxCALacZ lub PBS, podczas gdy chrząstka stawowa była dobrze zachowana u myszy leczonych adenowirusem CIS3 lub dnSTAT3 (Figura 3c, dane dla PBS nie zostały pokazane). Skutki adenowirusów CIS3 i dnSTAT3 były porównywalne (ryc. 3, d i e). Następnie zbadaliśmy wpływ ektopowej ekspresji CIS3 i dnSTAT3 na aktywację STAT3 (Figura 4a) i ekspresję cytokin (Figura 4b) w modelu AIA. Miejscowa ekspresja CIS3 i dnSTAT3 hamowała aktywację STAT3 po indukcji AIA w dniu 28. Analiza RT-PCR potwierdziła silną supresję wytwarzania IL-6 przez CIS3 i nadekspresję dnSTAT3 (Figura 4b). Jednak poziomy TNF-a, IL-ip i IL-10 nie były zmienione w stawach artretycznych (Figura 4b). Te wzory ekspresji cytokin były podobne do tych, które znaleziono w fibroblastach maziówkowych zainfekowanych adenowirusami CIS3 lub dnSTAT3 (Figura 2), jak również w modelach AIA u myszy z niedoborem IL-6 (8). Figura 4 Wpływ CIS3 i dnSTAT3 na aktywację STAT3 (a) i wytwarzanie cytokin (b) w modelu AIA. Wirusy CIS3, dnSTAT3 lub LacZ infekowano w dniu 6 po początkowej immunizacji mBSA. Stawy kostne usunięto i homogenizowano 28 dni po immunizacji. Stawkę kostną myszy nieleczonej użyto jako normalnej kontroli (normalnej). Ekstrakty komórkowe poddawano immunoblottingowi z antyfosforylowanymi Ab3 STAT3 lub anty-STAT3. (b) Dwadzieścia osiem dni po pierwszej immunizacji, całkowity RNA ekstrahowano ze stawów skokowych myszy zainfekowanych przez CIS3 (ścieżka 2), dnSTAT3 (ścieżka 3) lub LacZ (linia 4) adenowirusów w dniu 6 [więcej w: podkład match perfection, zapalenie woreczka łzowego, odżywki na mase mięśniową ] [patrz też: odżywki na mase mięśniową, jęczmień green ways, kotlety mielone bez jajka ]