Skip to content

Indukcja regulatora sygnału cytokin SOCS3 / CIS3 jako strategia terapeutyczna w leczeniu zapalenia stawów ad

3 miesiące ago

715 words

Stwierdziliśmy również, że CIS3 był skuteczniejszy niż dnSTAT3 w modelu CIA. Biorąc pod uwagę selektywną ekspresję genu CIS3 w komórkach maziowych, indukcja poziomów białka CIS3 może stanowić skuteczną nową strategię terapeutyczną w leczeniu RA. Metody Tkanki maziowe i izolacja synowiocytów. Próbki błony maziowej uzyskano od trzech pacjentów z RA podczas całkowitej operacji wymiany stawu lub synowektomii w Centrum Medycznym Kurume University. Wszyscy pacjenci spełnili kryteria American College of Rheumatology dotyczące RA (19). Tkanki maziowe były również pobierane od pacjentów z OA. Próbki te zostały pobrane za świadomą zgodą pacjentów. Aby wyizolować synowiocyty, zebrane tkanki maziówkowe trawiono 5 ug / ml kolagenazy (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) i 1,5 ug / ml DNazy (Sigma Chemical Co.) i przepuszczono przez siatka druciana do przygotowania izolowanych komórek. Komórki (5 x 105) umieszczono na 10-cm szalkach z 10 ml RPMI uzupełnionej 10% FCS, 2 mM L-glutaminą, 50 U / ml penicyliny i 50 ug / ml streptomycyny. Przy 80% konfluencji komórki usunięto przez trypsynizację i rozdzielono na kolejne kanały hodowlane. Zastosowano pasożyty 3. 7 komórek i uważano je za jednorodną populację fibroblastów. Rekombinowany adenowirus. Wektory adenowirusowe zawierające geny dla LacZ (AxCALacZ), znakowanego Myc CIS3 (AxCACIS3) i znakowanego HA dnSTAT3 (AxCAdnSTAT3) (18), które zawierają promotor CAG (promotor p-aktyny z kurczaka ze wzmacniaczem cytomegalowirusa) zostały przygotowane rekombinacja w komórkach 293, jak opisano poprzednio (20). Rekombinowany adenowirus z bakteryjnym genem LacZ kierowanym przez ten sam promotor, AxCALacZ, został dostarczony przez I. Saito z University of Tokyo. Preparaty wirusowe miareczkowano za pomocą testu tworzenia łysinek na 293 komórkach. Liczba cząstek wirusa (mierzonych w PFU) na komórkę wyrażono jako moi. W celu przeniesienia genów in vivo, wstrzyknięto 50 .l 2 × 109 PFU / ml rekombinowanych wirusów w soli fizjologicznej do stawów skokowych i stawów nadgarstkowych. Produkcja cytokin i testy proliferacji. Zakażenie hodowanych synowiocytów wektorami adenowirusowymi przeprowadzono zgodnie ze sposobem opisanym powyżej (20-22). W skrócie, komórki w kulturze inkubowano z adenowirusem (1010 PFU / ml) rozcieńczonym DMEM przez godzinę w 37 ° C, po czym dodano 10 objętości pożywki zawierającej 10% FBS. Po infekcji komórki usunięto przez trypsynizację i wysiano na 24-studzienkowe płytki w stężeniu 5 x 104 komórek / dołek w ml RPMI zawierającym 10% FCS. Kondycjonowaną pożywkę (CM) usunięto w różnych punktach czasowych i zamrożono w ~ 20 ° C aż do oznaczenia testem ELISA. Ilościowe oznaczenie IL-1 (3, TNF-a i IL-6 przeprowadzono przy użyciu zestawów od Biosource International (Camarillo, Kalifornia, USA). Testy proliferacji komórek przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (21, 22). Modele AIA i CIA oraz infekcja myszy przez adenowirusy. Samce myszy C57BL / 6 i myszy DBA / 1J zakupiono od SLC Japan Co. (Shizuoka, Japonia). W przypadku myszy AIA, myszy C57BL / 6 immunizowano śródskórnie u podstawy ogonka i cztery płytki z 100 .g metylowanego BSA (mBSA, Sigma Chemical Co.) emulgowanego z równą objętością kompletnego adiuwanta Freunda (Difco Laboratories, Detroit). , Michigan, USA) zgodnie z opisem (8, 22). Wstrzyknięto im 2 × 109 organizmów Bordetella pertussis (Kaken Pharmaceutical, Tokio, Japonia). Tę procedurę powtórzono w dniu 7. W dniu 21 100 .g mBSA w 10 ml soli fizjologicznej wstrzyknięto w dwustronne stawy skokowe. Adenowirus wstrzyknięto do stawów skokowych w dniu 6. CIA indukowano za pomocą ustalonych metod, jak opisano wcześniej (23, 24). Pokrótce, myszy DBA / 1J immunizowano przez śródskórne wstrzyknięcie u podstawy ogona 100 .g kolagenu bydlęcego typu II (Cosmo Bio Co., Tokio, Japonia) w 0,05 M kwasie octowym, zemulgowanym z równą objętością Freunda. s kompletny adiuwant. W dniu 21 myszy otrzymały dawkę przypominającą śródskórnego wstrzyknięcia i taką samą objętość niekompletnego adiuwanta Freunda. Aby zsynchronizować początek zapalenia stawów, wstrzyknięto dootrzewnowo 40 .l LPS w dniu 28. Adenowirus wstrzyknięto do stawów skokowych i nadgarstków w dniu 28 lub w dniu 32. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt przeprowadzono zgodnie z wytycznymi etyki doświadczeń na zwierzętach. Komitet naszych instytucji. Kliniczna ocena zapalenia stawów. Rozwój CIA był kontrolowany co drugi dzień, a stan zapalny czterech łap oceniano od 0 do 4: stopień 0, łapy bez opuchlizny i zaczerwienienie; stopień 1, łapy z obrzękiem stawów palców; stopień 2, łapy z łagodnym obrzękiem stawów skokowych lub nadgarstkowych; stopień 3, łapy z ciężkim zapaleniem całych łap; i stopień 4, łapy ze zniekształceniem lub zesztywnieniem
[hasła pokrewne: jak bezpiecznie spędzić wakacje, fit med salon, leczenie kanałowe białystok ]
[patrz też: podkład match perfection, pocałunek w policzek sennik, fitomed krem nawilżający tradycyjny ]