Skip to content

Indukcja regulatora sygnału cytokin SOCS3 / CIS3 jako strategia terapeutyczna w leczeniu zapalenia stawów cd

3 miesiące ago

717 words

Każda łapa była oceniana i cztery wyniki były sumowane, tak że maksymalny możliwy wynik na mysz wynosił 16. Badanie histologiczne i immunohistochemiczne. Nogi i tylne łapy myszy usunięto, utrwalono 4% paraformaldehydem w PBS, a następnie odwapniano przez 10 dni za pomocą EDTA i zatopiono w parafinie. Skrawki parafiny barwiono hematoksyliną eozyną i Safranin O-fast green. Szkiełka zostały ocenione histologicznie przez dwóch niezależnych obserwatorów, a stopień artretyzmu oceniano od 0 do 4 w zależności od intensywności przerostu warstwy wykładzinowej, infiltracji komórek jednojądrzastych i formowania łuszczki, jak opisano wcześniej (23): 0, normalne staw skokowy ; 1, normalna błona maziowa z okazjonalnymi komórkami jednojądrzastymi; 2, określone zapalenie stawów, kilka warstw płaskich do zaokrąglonych komórek wyściółki maziowej i rozproszonych jednojądrzastych komórek; 3, wyraźna przerost błony maziowej z trzema lub więcej warstwami luźno ułożonych komórek okładzinowych i gęstą infiltracją komórkami jednojądrzastymi; 4, ciężkie zapalenie błony maziowej z łuszczką i nadżerkami chrząstki stawowej i kości podchrzęstnej. W celu barwienia LacZ, tkankę zainfekowaną adenowirusem LacZ utrwalono 4% formaliną i inkubowano przez noc w 37 ° C w roztworze X-gal [5 mM K4Fe (CN) 6; 5 mM K3Fe (CN) 6; 2 mM MgCl2; i 2 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-P-galaktozyd w PBS] jak opisano (21). Immunoblot, hybrydyzacja Northern i analiza RT-PCR. Tkanki maziowe izolowano z tylnych łap poprzez usuwanie skóry, mięśni, tkanek tłuszczowych, kości i ścięgien, a następnie natychmiast zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze ~ 80 ° C. Całe tkanki stawów myszy i próbki ludzkich pacjentów bez kości homogenizowano w 2. 4 ml buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,5% NP-40, mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% glicerol, mM wanadan sodu, 50 mM fluorku sodu, 10 mM pirofosforanu sodu i mM PMSF z koktajlem inhibitora proteazy (Sigma Chemical Co.) (17). Ekstrakty oczyszczono przez wirowanie przy 10000 gw temperaturze 4 ° C przez 15 minut, a następnie rozcieńczono buforem do lizy, aby osiągnąć stężenie białka około 2 mg / ml. Całkowite ekstrakty komórkowe rozdzielono metodą SDS-PAGE, a białka wykrywano metodą immunoblotingu, jak opisano (17). Specyficzne dla anty-fosfo-STAT3 (3 nabyto z New England BioLabs Inc. (Beverly, Massachusetts, USA) i Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, New York, USA). Całkowity RNA z różnych rodzajów tkanek został przygotowany za pomocą TRIzol (Life Technologies Inc., Grand Island, Nowy Jork, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowity RNA (5 ug) rozdzielono na 1% żelu agarozowym zawierającym 2,4% formaldehydu, a następnie przeniesiono na dodatnio naładowane membrany nylonowe. Po utrwaleniu w kalibrowanym napromieniowaniu ultrafioletem, membrany hybrydyzowano z znakowanymi digoksygeniną (znakowanymi DIG) rybosonami i wizualizowano za pomocą znakowanego alkalicznie fosfatazy anty-DIG Ab zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Molecular Biochemicals Inc., Mannheim, Niemcy). . Sonda cDNA dla CIS3 i GAPDH została opisana wcześniej (17). W przypadku RT-PCR, startery dla mysich IL-1 p, IL-6, TNF-a i IL-10 opisano uprzednio (17, 25) wykryto standardowymi metodami RT-PCR, stosując standardowy zestaw PCR GeneAmp RNA (PE Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Metody statystyczne. Znaczenie różnicy między środkami grup określano za pomocą testu U Manna-Whitneya w programie SigmaStat (SPSS Software Products, Chicago, Illinois, USA). Wyniki Aktywacja STAT3 i indukcja CIS3 u pacjentów z RA i mysich modeli RA. Wykazaliśmy, że STAT3 jest skorelowany z ciężkością zapalenia jelit (17). Najpierw porównaliśmy aktywację STAT3 u pacjentów z RA i OA, stosując immunohistochemię z przeciwciałami anty-fosfo-STAT3 (3. Jak pokazano na rysunku 1a, aktywowany STAT3 wykryto w jądrze komórek maziówkowych RA, ale nie w próbkach OA. Sugeruje to, że aktywacja STAT3 jest związana z hiperplazją tkanek maziowych. Wykazaliśmy również, że supresor sygnału cytokiny CIS3 jest indukowany w zapaleniu jelita grubego (17). W związku z tym zbadaliśmy ekspresję CIS3 u pacjentów z RA i OA za pomocą analizy Northern blot. Jak pokazano na Figurze 1b, CIS3 był silnie eksprymowany w tkankach maziówkowych od pacjentów z RA, ale tylko słabo w tkankach maziówkowych OA. Figura Aktywacja CIS3 i STAT3 w tkance maziówkowej od pacjentów z RA i OA. (a) Immunohistochemiczne wykrywanie aktywowanego STAT3 w tkankach maziowych. Szkiełka z pociętymi tkankami o grubości 7 mm wybarwiono immunologicznie przeciwciałami specyficznymi wobec anty-fosfo-STAT3 (3 (P-STAT3) i lekko zabarwiono hematoksyliną.
[podobne: leczenie kanałowe białystok, zapalenie woreczka łzowego, fit med ]
[podobne: green ways jęczmień, fit med salon, fitmed ]