Skip to content

Komórki T CD4 + swoiste dla kłębuszkowego antygenu błony podstawnej pośredniczą w kłębuszkowym zapaleniu nerek ad

2 miesiące ago

366 words

Zatem komórki T CD4 + specyficzne względem antygenu per se są wystarczające do spowodowania uszkodzenia kłębuszków nerkowych. Metody Ab. Znakowany biotyną anty-szczurzy CD3 (G.4.18), znakowany biotyną anty-szczurzy CD11b / c, znakowany fikoerytryną (wyznakowany PE) anty-szczurzy CD4 (OX35), znakowany FITC anty-szczurzy IFN-y (DB-1), znakowany PE znakowany anty-szczurzą IL-4 (OX-81) Ab., Znakowany FITC szczurzy IgG-1 i znakowany izotopem PE szczur IgG-2 kontroli izotypowej otrzymano od PharMingen (San Diego, USA). Kalifornia, USA). Znakowane FITC anty-szczurzy IgG, znakowane FITC anty-szczurze IgM, znakowane peroksydazą anty-szczurze przeciwciała IgG IgG i oczyszczone szczurze IgG otrzymano z Southern Biotechnology Associates (Birmingham, Alabama, USA) i FITC. szczurzy C3 Ab uzyskano z ICN Radiochemicals Inc. (Costa Mesa, Kalifornia, USA). Substancje znakowane biotyną lub FITC Ab SR-13 i SR-6 były dobrymi prezentami od Y. Sado, Uniwersytetu Okayama, Okayama City, Japonia. SR-13 reaguje głównie z GBM, podczas gdy SR-6 reaguje zarówno z GBM, jak i cylindryczną membraną podstawową (TBM). Ocena immunizacji i GN. Samice szczurów Wistar-Kyoto (w wieku 4. 6 tygodni) zakupiono od Harlan (Indianapolis, Indiana, USA). Szczury trzymano w ośrodku dla zwierząt w University of Texas Houston Health Science Center i pozwolono im aklimatyzować się przez 3 dni. Szczury immunizowano 300 .g rekombinowanego Col4a 3NC1 zemulgowanego w CFA w jednej tylnej łapie stopy i u podstawy ogona (24). Limfocyty izolowano od immunizowanego szczura w celu wytworzenia linii komórek T. Szczury immunizowane samym CFA służyły jako kontrole. GN został oceniony przez białkomocz i histopatologię nerek. Losowe próbki moczu były monitorowane codziennie przez Multstix (Bayer Corp., Pittsburgh, Pennsylvania, USA), a wybrane próbki analizowano w Clinical Chemistry Laboratory, Texas Children s Hospital, Baylor College of Medicine, zaczynając od dnia 14. Albumina z moczem była półwyspieszone 12% SDS-PAGE (2 .l moczu / ścieżki) przy użyciu BSA jako wzorca. Zwierzęta doświadczalne uśmiercano, jak wskazano. Tkanki nerkowe utrwalone w utrwalaczu Bouina zostały użyte do barwienia hematoksyliną i eozyną i utrwalone w 10% formalinie do okresowego kwasu – barwienia Schiff, Trichrome lub Jonesa. Część tkanki nerkowej została szybko zamrożona w ciekłym azocie w celu bezpośredniego barwienia immunofluorescencyjnego. Na podstawie odsetka kłębuszków z formacją półksiężycową, GN oceniono jako ciężki (> 50%), skromny (<50%, ale> 5%) lub prawidłowy (<5%). Naciekające komórki T identyfikowano poprzez barwienie immunoperoksydazowe z anty-szczurzym mAb CD3, monocytami / makrofagami przez anty-szczurzą mAb CD11b / c i komórki B przez barwienie immunofluorescencyjne anty-szczurzym IgM / IgG. Test proliferacji limfocytów i generowanie linii komórek T. Test proliferacji limfocytów (LPA) przeprowadzono jak opisano wcześniej (24). W skrócie, limfocyty T i napromieniowane tymocyty (w stosunku 1: 1) hodowano w 96-studzienkowych płytkach w 4 x 105 komórek / studzienkę w 200 ul kompletnego podłoża komórek T. Strawione białka GBM szczura (24) lub rCol4a3NC1 (0,1 a 10 ug / ml) dodano do każdej studzienki w trzech powtórzeniach, a oczyszczoną pochodną białkową (PPD) zastosowano jako kontrolę pozytywną. Komórki inkubowano w 37 ° C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 72 godziny, pulsowano 3H-tymidyną, 0,5. Ci / studzienkę, przez 18 godzin (ICN Radiochemicals Inc.) i zebrano na filtrach z włókna szklanego stosując półautomatyczny kombajn do kombajnów. Włączoną radioaktywność mierzono za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego (Beckman Instruments Inc., Fullerton, California, USA). Wyniki wyrażono jako średnie trzykrotne cpm z antygenem minus średnie trzykrotne cpm bez antygenu (cpm). Podobny protokół zastosowano do stymulacji komórek T do wytwarzania linii komórek T. Limfocyty wyizolowane od immunizowanych szczurów były stymulowane przez rCol4a3NC1 przez 4 dni i zbierane przez dwa wirowanie w gradiencie za pomocą Histopaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) w celu całkowitego usunięcia martwych komórek i pozostawania rCol4a3NC1. Komórki pozostawiono do odpoczynku przez 7 dni w obecności 2,5% supernatantu stymulowanych Con-A (S (Sigma Chemical Co.) normalnych komórek śledziony szczura. W oparciu o nasze doświadczenia, dodanie napromieniowanych syngenicznych tymocytów podczas odpoczynku było konieczne do wyczerpania potencjalnych samoreaktywnych komórek T. Po pierwszej stymulacji komórki T stymulowano w obecności napromieniowanych syngenicznych tymocytów. Komórkowy skład linii komórek T oznaczono dwiema metodami. Po pierwsze, komórki wybarwiono anty-CD4-PE i anty-szczurzym Abis IgM / IgGa, a następnie analizami cytometrii przepływowej (FACSCalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA). Po drugie, supernatanty po każdej stymulacji zebrano w celu wykrycia aktywności Ab metodą analizy Western blot i szczurzych IgG w teście ELISA, stosując oczyszczone szczurze IgG jako standard, jak opisano (24). Po ponad trzech cyklach stymulacji do przeniesienia użyto linii komórek T [więcej w: podkład match perfection, atopowe zapalenie skory zdjecia, zapalenie woreczka łzowego ] [hasła pokrewne: kotlety mielone bez jajka, sennik pocałunek w policzek, zapalenie woreczka łzowego ]