Skip to content

Komórki T CD4 + swoiste dla kłębuszkowego antygenu błony podstawnej pośredniczą w kłębuszkowym zapaleniu nerek cd

1 miesiąc ago

714 words

Wykrywanie cytokin przez wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin i RT-PCR. Komórki T pod koniec okresu odpoczynku stymulowano kombinacją PMA (500 nM) (AG Scientific, San Diego, Kalifornia, USA) i jonomycyny (32 nM) (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pennsylvania, USA) dla 8 godzin i do inkubacji dodano GolgiStop (PharMingen) przez 4 godziny. Zestaw z PharMingen został użyty do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin z znakowanym FITC anty-szczurzym INF-. i przeciwciała anty-szczurzy IL-4 znakowane PE. Niewielka część nieutrwalonych komórek T była wybarwiona przez anty-szczurzy CD4 Ab wyznakowany PE. Próbki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Cytokiny oznaczano również za pomocą RT-PCR. Milion komórek T w spoczynku lub zebranych po stymulacji specyficznej dla antygenu użyto do wyizolowania całkowitego RNA przy użyciu zestawu z Ambion Inc. (Austin, Texas, USA), a cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu RT-PCR (Sigma Chemical Co. ). Przeprowadzono PCR w celu wykrycia ekspresji IL-4 i INF-y. zgodnie z opublikowaną metodą (25). Produkty PCR wizualizowano za pomocą barwienia bromkiem etydyny po szybkiej elektroforezie w żelu agarozowym (RAGE). Eksperymenty z etykietowaniem komórek T. Aktywowane komórki T wyznakowano CFDA-SE (ester sukcynoimidylowy 5/6-karboksyfluoresceiny dioctan, 37,5 (M w DMSO) (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA), jak opisano poprzednio (26). Wyznakowane komórki wstrzyknięto szczurom z ekspresją toksyny krztuścowej (60 x 106 komórek / szczura). Jako kontrolę, komórki T od szczurów immunizowanych CFA aktywowano za pomocą Con-A, znakowano i przenoszono na szczury stymulowane przez krztusienie. Odbiorców uśmiercono 24 godziny później. Wyizolowano obwodowe białe krwinki. Różne organy, w tym płuca, jelito, wątroba, trzustka, śledziona, węzły chłonne, grasica i nerka zostały wycięte w celu (a) izolacji komórek pod kątem cytometrii przepływowej poprzez trawienie kolagenazą D (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) opublikowany sposób (27) i (b) obserwacja zamrożonych skrawków przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Niektóre komórki pozostały w hodowli jako kontrola pozytywna. Oznaczone komórki w korze nerki zliczono w więcej niż dziesięciu seryjnych zamrożonych skrawkach (5 .m). Obszary sekcji obliczono za pomocą komputerowego programu do analizy obrazu (Alpha Innotech, San Leandro, Kalifornia, USA). Gęstość wyznakowanych komórek w korze obliczono następująco: gęstość komórek (komórki / mm3) = oznaczony numer komórki / obszar przekroju (mm2) × 0,005 mm x numer sekcji. Dane analizowano za pomocą testu t. Niektóre skrawki wybarwiono anty-GBM Ab, SR-13, aby ujawnić lokalizację znakowanych limfocytów T. Wyniki Charakteryzacja linii komórek T specyficznych dla Col4a 3NC1. Wykazaliśmy uprzednio, że komórki T od szczurów immunizowanych rCol4a3NC1 odpowiadały nie tylko na rCol4a3NC1, ale także na trawione białka GBM (24). Swoistość antygenową linii komórek T (w sumie trzy) wytworzonych ze szczurów immunizowanych rCol4a 3NC1 określano po każdym cyklu stymulacji. Nie było niespodzianką stwierdzenie, że linie komórek T reagowały zarówno z rCol4 (3NC1 i trawionymi białkami GBM (Figura 1). Cytometria przepływowa wykazała, że linie komórek T po trzecim cyklu stymulacji składały się z ponad 98% komórek T CD4 + zasadniczo bez komórek IgG / IgMp-pozytywnych (Figura 2a). Supernatanty zebrane po każdej stymulacji analizowano pod kątem stężenia szczurzego IgG i Ab do rCol4a3NC1. Szczurze IgG, jak również Ab do rCol4a3NC1, mogą być dobrze wykryte w supernatantach po pierwszej stymulacji, ale szybko stały się niewykrywalne po trzeciej stymulacji (Figura 2b). Niewykrywalna aktywność IgG szczura i Ab w supernatantach potwierdziła brak specyficznych dla antygenu komórek B w liniach komórek T. Figura Specyficzność antygenowa linii komórek T wytworzonej ze szczura immunizowanego rCol4a 3NC1. (a) Linię komórek T rCol4a 3NC1 (wypełnione kółka) lub komórki T szczura immunizowanego CFA (puste kółka) inkubowano z różnymi stężeniami rCol4a3NC1 (oś x) w obecności napromieniowanych syngenicznych tymocytów. Proliferację komórek T zmierzono jako pobór 3H (cpm, oś y). (b) komórki T. odpowiedzi na trawiony szczur GBM. Figura 2 Komórkowy skład linii komórek T specyficznych dla rCol4a 3NC1. (a) Analiza metodą cytometrii przepływowej całych limfocytów ze szczurów immunizowanych rCol4a 3NC1 (górny panel) i linii komórkowej T (dolny panel). (b) Szczurowe stężenie IgG w supernatantach dwóch linii komórek T Col4a 3NC1 (puste kółka i kwadraty) i jedna kontrolna linia komórek T CFA (wypełnione kółka) zebrane po każdej stymulacji (oś x)
[patrz też: portius krosno godziny otwarcia, poliploidalność, niedobór witaminy d u dorosłych objawy ]
[przypisy: glykopeel, poliploidalność, młody jęczmień green ways ]