Skip to content

Komórki tuczne odgrywają kluczową rolę w rekrutacji neutrofili w eksperymentalnym pemfigoidzie pęcherzykowym ad

1 miesiąc ago

705 words

Zakres choroby skórnej oceniano następująco: Brak wykrywalnej choroby skóry; 1+, łagodna rumieniowa reakcja bez śladu oderwania naskórka. znak (ten znak został wywołany delikatnym tarciem skóry myszy, która, gdy była pozytywna, wytworzyła drobne, trwałe zmarszczenie naskórka); 2+, intensywny rumień i naskórkowy znak odrywania obejmujący 10. 50% naskórka na obszarach zlokalizowanych; i 3+, intensywny rumień ze szczerym naskórkowym znakiem oderwania obejmującym więcej niż 50% naskórka. Zwierzęta następnie zabito i otrzymano próbki skóry i surowicy. Skrawki skóry wykonano dla mikroskopii świetlnej (barwienie hematoksyliną i eozyną [H & E]) i dla bezpośredniej analizy IF dla wykrycia króliczego IgG i depozycji mysiego C3 w strefie błony podstawnej (BMZ). Surowice wstrzykniętych zwierząt wykorzystano do pośredniego testu IF w celu określenia krążących mian przeciwciał anty-mBP180. Bezpośrednie i pośrednie analizy IF przeprowadzono jak opisano wcześniej (13). Monospecyficzne sprzężone z FITC kozie anty-królicze IgG zakupiono od Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. (Gaithersburg, Maryland, USA); monoswoistą kozę przeciw myszy C3 zakupiono z Cappel Laboratories (Durham, Karolina Północna, USA). Kwantyfikacja akumulacji PMN w miejscu skóry. Aktywność mieloperoksydazy (MPO) w miejscach skóry zwierząt, którym wstrzyknięto testowano jako miarę infiltracji PMN, jak opisano w innym miejscu (17, 18). Standardową krzywą odniesienia ustalono stosując oczyszczone MPO (Athens Research and Technology Inc., Ateny, Georgia, USA). Próbki skóry ekstrahowano przez homogenizację w buforze ekstrakcyjnym zawierającym 0,1 M Tris-Cl (pH 7,6), 0,15 M NaCl i 0,5% bromku heksadecylotrimetyloamoniowego. Aktywność MPO w frakcji supernatantu mierzono zmianą gęstości optycznej przy 460 nm wynikającą z rozkładu H2O2 w obecności o-dianizydyny. Zawartość MPO wyrażono jako jednostki aktywności MPO na miligram białka. Stężenia białek określono za pomocą testu wiązania barwnika Bio-RAD (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) stosując standard BSA. Oznaczanie ilościowe MC i degranulacji MC. Degranulację MC i MC w próbkach skóry oznaczono ilościowo według Wershila i in. (19) z modyfikacją. W skrócie, zmiany skórne i niejonowe odcinki skóry u myszy, którym wstrzyknięto IgG, utrwalono w 10% formalinie. Skrawki parafiny (o grubości 5 urn) przygotowano i wybarwiono błękitem toluidyny i H & E. Całkowita liczba MC została policzona i sklasyfikowana jako degranulowana (> 10% granulek wykazujących fuzję lub rozładowanie) lub normalna w pięciu polach pod mikroskopem świetlnym, jak opisano wcześniej. Wyniki wyrażono jako procent degranulacji MC. Analiza mikroskopowa elektronów morfologii MC. Próbki skóry wycięto z miejsc wstrzyknięcia testowanych i kontrolnych zwierząt i zanurzono w utrwalaczu 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,2). Bloki tkankowe utrwalono za pomocą OsO4, a następnie odwodniono za pomocą szeregu stopniowanych etanolu. Cienkie skrawki skontrastowano z octanem uranu i cytrynianem ołowiu i zbadano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego Hitachi-600 (Hitachi Instruments Inc., San Jose, Kalifornia, USA) przy 75 KV. Hamowanie in vivo degranulacji MC. Noworodkom myszy typu dzikiego wstrzyknięto śródskórnie patogenną IgG (2,5 mg na gram masy ciała) pod nieobecność lub obecność kromoliny sodu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) (10 .g na gram ciała). waga), inhibitor degranulacji MC (20, 21). Zwierzęta badano na blistry kliniczne 12 godzin po wstrzyknięciu IgG, a skrawki skóry analizowano za pomocą IF, H & E i barwienia błękitem toluidynowym. Naciek PMN skóry oceniano ilościowo za pomocą testu MPO. Izolacja PMN. PMN myszy zostały wyizolowane z heparynizowanej krwi przez sedymentację dekstranu, a następnie rozdzielenie na gradiencie gęstości, jak opisano poprzednio (22). Czerwone krwinki zostały usunięte z preparatu komórek przez hipotoniczną lizę w 0,2% NaCl. PMN przemyto i ponownie zawieszono w zimnym PBS / 10 mM glukozy, policzono w hemocytometrze i doprowadzono do stężenia × 107 komórek / ml. Czystość PMN końcowego preparatu komórkowego wynosiła stale więcej niż 96%, jak określono metodą barwienia komórek-cytospin i LeukoStat (Fisher Diagnostics, Orangeburg, New York, USA). Żywotność granulocytów obojętnochłonnych wynosiła> 96%, co określono na podstawie wykluczenia błękitem trypanowym. Śródskórne wstrzyknięcie PMNs. PMN oczyszczono od myszy z niedoborem MC i MC + / +. Myszom z niedoborem MC wstrzyknięto śródskórnie patogenne IgG anty-mBP180 (2,5 mg na gram masy ciała na 50 ul PBS)
[przypisy: fitmed, jak bezpiecznie spędzić wakacje, podkład match perfection ]
[podobne: green ways jęczmień, fit med salon, fitmed ]