Skip to content

Mutacja zmiany sensu w KCNA1 kodującym bramkowany kwasem potasowym genu kanału potasowego związana jest z ludzką autosomalną dominującą hipomagnezemią. ad 6

2 tygodnie ago

692 words

W tym czasie poziom Mg2 + w surowicy był tak niski jak 0,28 mmol / l. Ponadto 18 innych członków rodziny wykazało podobne objawy kliniczne i cechy biochemiczne. Proband został przetestowany pod kątem oznak dysfunkcji móżdżku i stwierdził, że przeszedł kilka okresów, podczas których nie był w stanie chodzić prosto. Obiektywne objawy kliniczne dysfunkcji móżdżku, w tym oczopląs, wieloetapowe lub przekrwione sakady, dysmetria w teście palca i nosa oraz rozkład ruchu nóg na próbie piętę-łydka, były nieobecne. Jednak na MRI mózgu z probanda, znaleźliśmy dowody lekkiej atrofii mózgu (dane nie pokazane). Ponadto, elektromiografy niektórych dotkniętych członków wykazywały wydzielanie miokymiczne zgodnie z uprzednio obserwowanym mieszanym fenotypem. Zebraliśmy próbki krwi członków rodziny (zarówno dotkniętych, jak i niezmienionych, rysunek 1A) do analizy sprzężeń. Następnie DNA ekstrahowano zgodnie ze standardowymi protokołami. Kontrolne próbki genomowego DNA (n = 100) dostarczył H. van Bokhoven (Wydział Genetyki Człowieka, Centrum Medyczne Nijmegen Uniwersytetu Radboud). Analiza powiązań genetycznych. Podejście obejmujące całe genom zostało przeprowadzone dla 12 członków rodziny wybranych na podstawie symulacji w SLINK (29) przy użyciu macierzy Affirmet GeneChip Mapping 10K 2.0, zawierającej 10 204 SNP. Przygotowanie próbki i hybrydyzację przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta (Affymetrix) (30). W skrócie, 250 ng genomowego DNA trawiono za pomocą 10 U XbaI (Westburg), a następnie ligowano przy użyciu ligazy DNA T4 (Westburg) uniwersalnych adapterów do strawionych produktów. Do amplifikacji strawionych produktów zastosowano startery komplementarne do adapterów. Po oczyszczeniu produktów z użyciem płytek MinElute (QIAGEN), fragmentację przeprowadzono na 20 .g oczyszczonego produktu PCR. Rozdrobnione produkty znakowano końcowo i hybrydyzowano z Affymetrix 10K GeneChip przez noc. Hybrydyzowane macierze przepłukano i wybarwiono stosując Fluidics Station 400 (Affymetrix). Skaner GeneChip 3000 był używany do skanowania zhybrydyzowanych macierzy. Automatyczne wywołania SNP generowano przy użyciu oprogramowania do analizy DNA GeneChip (GDAS, Affymetrix). Wywołania SNP to AA lub BB dla homozygotycznych SNP, AB dla heterozygotycznych SNP. Gdy oprogramowanie nie było w stanie nawiązać połączenia (AA, BB lub AB), SNP otrzymało ocenę brak połączenia . Oprogramowanie Merlin (www.sph.umich.edu/csg/abecasis/Merlin/index.html) zostało użyte do obliczenia oceny lod. Osiem markerów mikrosatelitarnych (D12S1626, D12S1725, D12S99, D12S374, D12S1623, D12S336, D12S77 i D12S89) wybrano do precyzyjnego odwzorowania nowo zidentyfikowanych loci hipomagnezemii na krótkim ramieniu chromosomu 12 (Human Genome Browser Gateway; http: // genom .ucsc.edu / cgi-bin / hgGateway). Analizę markera z zastosowaniem znakowanych fluorescencyjnie starterów przeprowadzono zgodnie z protokołem dla zestawu mapowania powiązań MD10 wersja 2.5 (Applied Biosystems). Reakcje dla każdego markera przeprowadzono oddzielnie, a produkty przed połączeniem z puzzlem łączono w zestawy o określonych rozmiarach i etykietach. Znaczniki zostały wpisane na analizatorze DNA ABI 3730 (Applied Biosystems) przy użyciu oprogramowania GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems). Allel binning został wykonany przy pomocy makr programu Excel 2000 (Microsoft) opracowanego przez van Campa i współpracowników (31), a my sprawdziliśmy dziedziczenie alleli Mendelianem przy użyciu oprogramowania PedCheck 1.0 (http://watson.hgen.pitt.edu/register/ docs / pedcheck.html) (32). Multipoint lod score i analizę haplotypów wykonano za pomocą GeneHunter, wersja 2.1 wydanie 5, w pakiecie oprogramowania easyLINKAGE (33) i oprogramowaniu Haplopainter (haplopainter.sourceforge.net/html/index.html). Analiza mutacji. Z krytycznego regionu wybraliśmy gen KCNA1 do analizy mutacji, używając bazy danych UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/). Reakcje amplifikacji DNA przeprowadzono w termocyklerze z ogrzewaną pokrywą (PTC-200; MJ Research). Sekwencję egzonu KCNA1 i regiony flankujące amplifikowano z genomowego DNA indywidualnego III-1 (Figura 1A) stosując wiele zachodzących na siebie zestawów starterów w oparciu o kod dostępu GenBank BC101733 (Tabela uzupełniająca 1). Produkty PCR o prawidłowych rozmiarach zostały wybrane przez elektroforezę na żelu agarozowym DNA, po wycięciu, a następnie oczyszczeniu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu GenElute (Sigma-Aldrich) zgodnie z protokołem producenta. Fragmenty zsekwencjonowano na obu niciach, stosując zestaw do sekwencjonowania gotowego zestawu reakcyjnego ABI PRISM Big Dye Terminator v2.0 i analizator DNA ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems). Immunohistochemia. Immunohistochemię przeprowadzono jak opisano poprzednio (34)
[więcej w: portius krosno godziny otwarcia, atopowe zapalenie skory zdjecia, obliczanie zdolności kredytowej ]
[więcej w: atopowe zapalenie skory zdjecia, podkład match perfection, fundacja stwardnienie rozsiane ]