Skip to content

Mutacja zmiany sensu w KCNA1 kodującym bramkowany kwasem potasowym genu kanału potasowego związana jest z ludzką autosomalną dominującą hipomagnezemią. ad 7

2 miesiące ago

630 words

W skrócie, przeprowadzono koimmunohistochemiczne barwienie lub barwienie seryjnych skrawków dla Kv1.1 z TRPM6, kalbindyną D28K i AQP2 na odcinkach 7. M próbek zamrożonej myszy z nerkami. Kriosekacje nerki myszy inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 4 ° C z następującymi pierwszorzędowymi przeciwciałami: króliczymi anty-Kv1.1 (1: 300) (APC-009, Alomone Labs), świnkami morskimi anti-TRPM6 (1: 1000) ( 6), świnka morska anty-AQP2 (1: 1000) (dostarczona przez PMT Deen, Departament Fizjologii, Centrum Medyczne Uniwersytetu Nijmegen Radboud) i mysia anty-kalbindyna D28K (1: 750) (35). W celu wykrycia kalbindyny D28K i AQP2, skrawki inkubowano ze skoniugowanymi z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi Alexa Fluor. Zestaw do amplifikacji sygnału Tyramide (PerkinElmer) zastosowano po inkubacji z wtórnie skierowanymi przeciw kozie przeciw świnką i króliczymi kozimi przeciwciałami biotynowymi, aby odpowiednio uwidocznić Kv1.1 i TRPM6. Obrazy wykonano za pomocą systemu do obrazowania laserowego z konfokalnym obrazowaniem (FluoView FV1000, Olympus). Konstrukty DNA. Zmutowane sekwencje KCNA1 i N255D uzyskano przez amplifikację genomowego DNA odpowiednio od członka rodziny dotkniętego i dotkniętego chorobą, stosując, odpowiednio, startery 5a-GCCGAATTCGGCCACCATGACGGTGATGTC-3. i 5a-GCCGTCGACATGCAACAACGCATTGACAG-3 .. Oba produkty PCR klonowano do wektorów pCMV-SPORT6 (Invitrogen) przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i SalI po weryfikacji przez analizę sekwencji. Następnie, zarówno sekwencje KCNA1 typu dzikiego jak i N255D subklonowano przez wektor wejściowy Gateway pDONR221 do docelowego klonu IRES-GFP pCIneo, tworząc ludzkie KCNA1 pCIneo IRES GFP (dzikiego typu Kv1.1) i ludzkie KCNA1 N255D pCIneo IRES GFP ( K1.1 N255D). Konstrukcję pCIneo IRES GFP stosowano jako kontrolę (symulację) w eksperymentach. Strukturę dzikiego typu TRPM6 pCIneo IRES GFP opisano wcześniej (6). Elektrofizjologia. Komórki HEK293 hodowano i transfekowano jak opisano wcześniej (36). Zapis całokomórkowy przeprowadzono w sposób opisany w poprzednim badaniu (14). Zarejestrowane prądy Kv1.1 wywołano jak opisano wcześniej, stosując te same standardowe roztwory pipet i kąpieli (37). Potencjał membrany transfekowanych komórek HEK293 mierzono przy użyciu trybu cęgów prądowych, z ciągłym rejestrowaniem z prądu podtrzymującego 0 pA. Roztwór pipety zawierał (w mM): 140 KCl, Na2-ATP, 10 HEPES / KOH (pH 7,3). Roztwór do kąpieli zawierał (w mmol / l): 138 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 MgCl2, CaCl2, 10 glukozy i 10 HEPES / KOH (pH 7,3). Do pomiaru prądów, w których pośredniczy TRPM6, liniowa rampa napięcia od A100 do +100 mV (w ciągu 450 ms) była stosowana co 2 sekundy z potencjału utrzymywania 0 mV. Standardowy roztwór pipety zawierał (w mmol / l): 150 NaCl, 10 EDTA i 10 HEPES / KOH (pH 7,2). Roztwory pozakomórkowe zawierały 150 mmol / l NaCl, 10 mmol / l HEPES / KOH (pH 7,4). Analizę i wyświetlanie danych z patch clamp przeprowadzono przy użyciu oprogramowania IGOR Pro (WaveMetrics). Obecne gęstości uzyskano przez normalizowanie obecnej amplitudy do pojemności błony komórkowej. Biotynylacja powierzchni komórki. Komórki HEK293 przejściowo transfekowano stosując Lipofectamine 2000 (Invitrogen) z .g DNA Kv1.1 typu dzikiego, .g Kv1.1 N255D lub .g pozornego plazmidu lub kotransfekowano 0,5 .g Kv1.1 typu dzikiego i 0,5 g Kv1.1 N255D. Znakowanie powierzchni komórkowej biotyną przeprowadzono jak opisano wcześniej (38). 48 godzin po transfekcji przeprowadzono test biotynylacji. Komórki homogenizowano w ml buforu do lizy, jak opisano poprzednio (38), przy użyciu Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce, Thermo Scientific). Jeden procent całkowitej ilości białka zebrano jako próbkę wejściową. Następnie, biotynylowane białka (frakcja błony komórkowej) wytrącono przy użyciu kulek NeutrAvidin-agaroza (Pierce, Thermo Scientific). Ekspresję Kv1.1 analizowano za pomocą analizy immunoblotów dla wejścia i frakcji błony komórkowej przy użyciu przeciwciała monoklonalnego Kv1.1 (1: 1000). Chemikalia. Przeciwciało przeciwko śwince morskiej przeciwko AQP2 zostało dostarczone przez PM Deena (Centrum Medyczne Uniwersytetu Radboud w Nijmegen). Mysią anty-kalbindynę D28K zakupiono od Sigma-Aldrich. Królicze poliklonalne i mysie przeciwciała monoklonalne specyficzne dla Kv1.1 zakupiono z Alomone Labs i NeuroMab, odpowiednio dla immunohistochemii i Western blotting. DTX-K zakupiono od Sigma-Aldrich. Statystyka. Dane są wyświetlane jako średnie. SEM. Istotność statystyczną określono przy użyciu ANOVA z procedurą Tukeya. Różnice średnich z P <0,05 uznano za statystycznie istotne. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Prism (GraphPad). Materiały uzupełniające Zobacz Uzupełnienia danych Podziękowania Autorzy są wdzięczni naszym kolegom K Lee, F. van Zeeland, A. Forst, M. Schijvenaars i R. Makkinje za pomoc techniczną i pomocne wskazówki oraz CE Silvado i LC Werneck za rekrutację pacjentów i ich krewnych. Badanie to zostało wsparte finansowo przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (ZonMw 9120.6110, ALW 700.55.302), nagrodę Europejskiego Młodego Odkrywcy z Europejskiej Fundacji Nauki oraz holenderską fundację nerek (C03.6017). Przypisy Komentarz do autora: Bob Glaudemans i Jenny van der Wijst w równym stopniu przyczynili się do tej pracy. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Zastosowano niestandardowe skróty: AQP2, akwaporyna-2; CNT, łączący kanalik; DCT, dystalne, zwinięte kanaliki; DTX-K, dendrotoksyna K; EA1, ataksja epizodyczna typu 1; Kv1.1, podtypu kanału potasowego bramkowanego napięciem 1.1; TRPM6, kanał kationowy potencjału receptora przejściowego, podrodzina M, członek 6. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.119: 936. 942 (2009). doi: 10.1172 / JCI36948 Zobacz pokrewny artykuł w Zakodowanej napięciem podjednostce kanału K + Kv1.1 łączy nerkę i mózg. [więcej w: atopowe zapalenie skory zdjecia, sennik pocałunek w policzek, dieta dukana przepisy faza 1 ] [hasła pokrewne: fitomed krem nawilżający tradycyjny, green ways jęczmień, fit med salon ]