Skip to content

Mutacja zmiany sensu w KCNA1 kodującym bramkowany kwasem potasowym genu kanału potasowego związana jest z ludzką autosomalną dominującą hipomagnezemią. cd

4 tygodnie ago

79 words

Biorąc pod uwagę dziedziczenie autosomalne dominujące w naszej rodzinie, badaliśmy potencjalny dominujący negatywny efekt przez kotransfekcję równych ilości plazmidowego DNA kodującego Kv1.1 typu dzikiego, Kv1.1 N255D lub plazmidu pozornego w komórkach HEK293. Amplituda prądu K + w komórkach HEK293 koeksponujących Kv1.1 dzikiego typu i Kv1.1 N255D była znacząco zmniejszona w porównaniu z komórkami eksprymującymi sam Kv1.1 typu dzikiego lub koekspresją Kv1.1 typu dzikiego i plazmidu pozornego (P <0,05 ) (Figura 3C). Następnie, wpływ ekspresji Kv1.1 N255D na ilość kanałów Kv1.1 na błonie komórkowej badano za pomocą eksperymentów biotynylowania na powierzchni komórki. Jak pokazano na rysunku 3D, koekspresja Kv1.1 typu dzikiego i Kv1.1 N255D w komórkach HEK293 nie wpłynęła na lokalizację błony komórkowej Kv1.1 w błonie komórkowej. Warto zauważyć, że Kv1.1 był jednakowo wyrażany we wszystkich warunkach analizowanych w całkowitych lizatach komórkowych (Figura 3D, dolny panel). Ponieważ kanały Kv1.1 składają się z 4 podjednostek, wynik ten sugeruje, że podobne ilości zarówno kanałów homotetramerycznych Kv1.1 typu dzikiego, jak i Kv1.1 N255D i kanałów heterotetramerycznych złożonych z Kv1.1 typu dzikiego z Kv1.1 N255D znajdują się w błonie plazmatycznej. Figura 3 Analiza elektrofizjologiczna komórek HEK293 transfekowanych pozornym plazmidem, Kv1 typu dzikiego. (Kv1.1 WT) lub Kv1.1 N255D. (A) Reprezentatywne oryginalne ślady zewnętrznych prądów K + komórek transfekowanych pozorowanym plazmidem, Kv1.1 WT, Kv1.1 N255D lub Kv1.1 WT i plazmidu próbnego wywołanych skokami napięcia od <100 do +50 mV w 10-mV przyrosty, przykładane z potencjału trzymania wynoszącego. 80 mV, co 10 sekund. (B) Związki IV komórek transfekowanych pozorowanym plazmidem (kółka, n = 5), Kv1.1 WT (kwadraty, n = 11), Kv1.1 N255D (trójkąty, n = 10) i Kv1.1 WT i próbny plazmid (diamenty, n = 9). (C) Histogram przedstawiający średnią gęstość prądu przy +50 mV komórek transfekowanych pozornym plazmidem (n = 5), Kv1.1 WT (n = 11), Kv1.1 WT i pozorowanym plazmidem (n = 9), Kv1.1 WT i Kv1.1 N255D (n = 9) i Kv1.1 N255D (n = 10). * P <0,05, w porównaniu z próbą; P <0,05, w porównaniu z Kv1.1 WT. (D) Biotynylacja powierzchni komórek HEK293 transfekowanych pozorowanym plazmidem, Kv1.1 WT, Kv1.1 WT i plazmidem pozorowanym, Kv1.1 WT i Kv1.1 N255D i Kv1.1 N255D. Ekspresję Kv1.1 analizowano metodą immunoblotingu dla frakcji błony komórkowej (PM) i sygnału wejściowego z całych lizatów komórkowych (IP). Przedstawiono reprezentatywny immunoblot z 4 niezależnych eksperymentów. (E) Histogram przedstawiający średnią gęstość prądu przy +80 mV po 200 sekundach komórek kotransfekowanych za pomocą TRPM6 i plazmidu próbnego (n = 26), TRPM6 i Kv1.1 WT (n = 26) oraz TRPM6 i Kv1.1 N255D (n = 25). (F) Potencjał błonowy komórek transfekowanych pozorowanym plazmidem, Kv1.1 WT i Kv1.1 N255D po ostrej aplikacji DTX-K (10 nM), mierzony w trybie cęgów prądowych konfiguracji patch clamp całej komórki. Przedstawiono reprezentatywne nagrania z 8 niezależnych eksperymentów. Paski błędów oznaczają SEM. Kv1.1 reguluje napływ MgP + TRPM6 przez ustawienie potencjału błonowego. Ponieważ Kv1.1 i TRPM6 są obecne w tym samym segmencie nefronowym, zbadaliśmy, przez który mechanizm Kv1.1 kontroluje napływ Mg2 + przez TRPM6. Zbadaliśmy potencjalny bezpośredni wpływ Kv1.1 na aktywność TRPM6 poprzez analizę patch clamp. W tym celu TRPM6 (1,0 .g) kotransfekowano sztucznym plazmidem (0,1 .g), Kv1.1 typu dzikiego (0,1 .g) lub Kv1.1 N255D (0,1 .g) w komórkach HEK293. Prądy Na + z udziałem TRPM6 były praktycznie identyczne w 3 warunkach doświadczalnych (Figura 3E). Następnie, bieżący tryb clampowania techniki patch clamp wykorzystano do pomiaru potencjału błonowego komórek HEK293 eksprymujących dzikiego typu Kv1.1 lub Kv1.1 N255D. Znaczącą hiperpolaryzację (P <0,05) obserwowano w komórkach HEK293 dzikiego typu eksprymujących Kv1.1 (<39 <3 mV, n = 9) w porównaniu z pozornym plazmidem. lub komórki wykazujące ekspresję Kv1.1 N255Da ((3 ^ mV, n = 7, i A 8 <2 mV, n = 7, odpowiednio). Dendrotoksyna K (DTX-K, 10 nM), specyficzny bloker kanału Kv1.1, istotnie depolaryzował potencjał błonowy w komórkach ekspresjonujących dzikiego typu Kv1.1 (od <39 <3 mV do <14> 2 mV, n = 8, P <0,05) (Figura 3F). Potencjał błonowy pozornego plazmidu. lub zastosowanie komórek DTX-K nie wpływa na komórki wyrażające Kv1.1 N255D3 (Figura 3F). Ponadto, kotransfekcja dzikim typem Kv1.1 i Kv1.1 N255D powodowała pośrednią hiperpolaryzację w porównaniu z komórkami eksprymującymi tylko Kv1.1 typu dzikiego ((23. LmV vs. odpowiednio A 39. 3 mV, n =. 15, P <0,05). Wyniki te sugerują, że w porównaniu z normalnym kanałem Kv1.1 kanał Kv1.1 N255D zmniejsza potencjał ujemnej błony. Dyskusja W badaniu tym zidentyfikowaliśmy dużą rodzinę brazylijską z autosomalną dominującą hipomagnezemią [przypisy: zapalenie woreczka łzowego, młody jęczmień green ways, fitomed krem nawilżający tradycyjny ] [podobne: sennik pocałunek w policzek, zapalenie woreczka łzowego, glykopeel ]