Skip to content

Reostat translacyjny dla RFLAT-1 reguluje ekspresję RANTES w limfocytach T ad 5

2 tygodnie ago

186 words

Nadekspresja eIF4E spowodowała w przybliżeniu trzykrotny wzrost ilości RFLAT-1 wytworzonego z cDNA o pełnej długości. Przeciwnie, wpływ na translację konstruktu A U był minimalny, zgodnie z regulacją translacji zależnej od czapeczki. Figura 3 Nadekspresja eIF4E zwiększa poziomy białka RFLAT-1. (a i b) PBL aktywowane PHA poddano lizie w dniach 0, 1, 2, 3 i 5. Przeprowadzono analizę Western blot z anty-RFLAT-1 i anty-EIF4E Ab. Względną ilość białka eIF4E określono przez densytometrię, a następnie normalizowano do ilości p-pektyny na linii. Wyniki są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów (b). (c i d) Komórki S2-6 i S2-6-4E przejściowo transfekowano .g konstruktów ekspresyjnych RFLAT-1 w obecności .g pCMV (3-galu. EIF4E indukowano 48 godzin po transfekcji, a komórki zebrano 24 godziny później. Próbki poddano analizie Western blot z przeciwciałami anty. RFLAT-1 i anty-eIF4E. C, bez kontroli transfekcji DNA. Ilość białka RFLAT-1 została określona przez densytometrię i znormalizowana do Hsc70 na ścieżce i do aktywności (3-galaktozydazy w próbce (d). Wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. * P <0,05. Ekspresja RFLAT-1 zależy od fosforylacji 4E-BP. EIF4E jest regulowany na wielu poziomach (38). Jego aktywność jest hamowana przez wiązanie z rodziną białek represorowych translacji (4E-BP). 4E-BP są dezaktywowane przez fosforylację poprzez kaskadę sygnałową, która jest zależna od kinazy 3 fosfatydyloinozytolu (PI-3K) i obejmuje Akt / PKB i FRAP / mTOR (38). Aby zbadać późniejsze zdarzenia regulacji translacyjnej RFLAT-1, zbadano wpływ rapamycyny immunosupresyjnej na poziomy białka RFLAT-1, które hamują fosforylację 4E-BP przez wiązanie z docelowym FRAP / mTOR (38). Ludzka cytotoksyczna linia komórek T CD8 + IL-2a była wstępnie traktowana 100 nM rapamycyny, a następnie stymulowana 500 U / ml rIL-2. Jak pokazano na Figurze 4, a i b, leczenie rapamycyną spowodowało 1,5 do 2-krotny spadek ilości RFLAT-1, co sugeruje, że fosforylacja 4E-BP jest ważna w regulacji translacji RFLAT-1 podczas późnej aktywacji limfocytów T. Figura 4Rapamycyna hamuje ekspresję białka RFLAT-1. (aib) Linię komórkową CD8 + stymulowano rIL-2 i hodowano z lub bez rapamycyny przez 0, 2, 4 i 6 godzin. Lizaty poddano analizie Western blot z anty-RFLAT-1 Ab, anty-fosfo-4EBP-1 jako kontrolą dla efektu rapamycyny i anty-Hsc70. Względną ilość białka RFLAT-1 w każdej próbce oznaczono jak powyżej. Wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. * P <0,05. Rap, rapamycyna. Regulacja translacyjna RFLAT-1 zależy od sygnalizacji kinazy MAP. eIF4E jest fosforylowany w odpowiedzi na czynniki wzrostu, mitogeny i hormony (23). Fosforylowany eIF4E ma wyższe powinowactwo wiązania dla czapeczki (39) i tworzy bardziej stabilny kompleks eIF4F (40), co powoduje ulepszone tłumaczenie. Mnk1, fizjologiczna kinaza, która działa na eIF4E, znajduje się pod kontrolą zarówno szlaków przekazywania sygnałów p38 MAPK, jak i ERK-1/2 (41). Ostatnio Mnk1 jest zaangażowany w regulację translacji zależnej od czapeczki w HEK293 (42). Aby zbadać, czy Mnk1 uczestniczy w regulacji translacyjnej RFLAT-1 w komórkach T, zastosowaliśmy inhibitory p38 MAPK, SB203580 (SB) i ERK-1/2, PD98058 (PD). SB202474, związek pokrewny, który nie wpływa na p38 MAPK, zastosowano jako kontrolę. Ludzkie PBL aktywowano mitogenem i hodowano przez 3-5 dni w obecności lub nieobecności inhibitorów. Jak pokazano na rysunku 5a, PD spowodował trzykrotny spadek białka RFLAT-1, podczas gdy SB nie wywierało żadnego działania. Jednak w obecności obu inhibitorów ilość białka RFLAT-1 zmniejszyła się ponad 15-krotnie (SB + PD). Ten efekt synergistyczny wskazuje, że zarówno szlaki p38 MAPK, jak i ERK-1/2 są zaangażowane w regulację ekspresji genu RFLAT-1, zgodnie ze ścieżkami transdukcji sygnału prowadzącymi do fosforylacji Mnk1 i dalszą aktywacją eIF4E. Figura 5 Ekspresja RFLAT-1 jest regulowana przez kinazy MAP i Mnk1. (a) PBL z aktywacją PHA traktowano pożywką (C), 4 .M SB203580 (SB), 4 .M SB202474 (SB-C), 10 .M PD98058 (PD) lub obydwoma SB203580 i PD98058 (SB + PD ). Wykonano Western blot z anty-RFLAT-1, anty-ERK-1/2 i fosfospecyficznym anty-ERK-1/2 Ab. (b i c) Komórki Jurkat poddano elektroporacji za pomocą 5 .g samego wektora ekspresyjnego RFLAT-1 lub w kombinacji z 10 .l konstruktów eksprymujących Mnk1. Western blot sondowano anty-RFLAT-1, anty-FLAG M2 i anty-Hsc70, a ilość RFLAT-1 w próbkach określano jak powyżej [więcej w: portius krosno godziny otwarcia, warta ubezpieczenie turystyczne, podkład match perfection ] [hasła pokrewne: zapalenie woreczka łzowego, pomidory suszone przepis, jak bezpiecznie spędzić wakacje ]