Skip to content

Reostat translacyjny dla RFLAT-1 reguluje ekspresję RANTES w limfocytach T ad 6

1 miesiąc ago

8 words

Wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. * P <0,05. Mnk1 jest dodatnim regulatorem ekspresji RFLAT-1. Aby potwierdzić bezpośredni udział Mnk1 w regulacji translacji RFLAT-1, wektor ekspresyjny RFLAT-1 transfekowano z użyciem lub bez konstruktów eksprymujących Mnk1 typu dzikiego, konstytutywnie aktywną postać kinazy (T344E) i dominującego negatywnego mutanta Mnk1 (TAA). ) (43, 44) do komórek Jurkat T (ryc. 5, b i c). Ekspresja RFLAT-1 wzrosła o 40% w obecności konstytutywnie aktywnego Mnk1 (T344E), podczas gdy dominująca forma negatywna (TAA) znacząco hamowała (potrójnie) produkcję RFLAT-1, redukując białko do jego poziomów podstawowych (Figura 5, b i do). Podsumowując, nasze dane wskazują, że Mnk1 jest dodatnim regulatorem ekspresji RFLAT-1 w komórkach T. IL-2 indukuje ekspresję białka RFLAT-1. Ponieważ czynniki wzrostu, mitogeny i cytokiny mogą aktywować kaskadę transdukcji sygnału ERK-1/2, postawiliśmy hipotezę, że leczenie komórek T IL-2 szybko zwiększyłoby fosforylację i aktywność eIF4E, indukowało wytwarzanie białka RFLAT-1, a zatem zwiększyło Wyrażenie RANTES. Aby przetestować tę hipotezę, zastosowaliśmy linię komórkową T aktywowaną IL-2 (28). Wzrost ekspresji RANTES, mierzony za pomocą FACS, zaobserwowano już po 2 godzinach po stymulacji i osiągnął maksimum 4 godziny (Figura 6a). Po 6 godzinach wewnątrzkomórkowy RANTES powrócił do poziomu podstawowego. Przeanalizowaliśmy również ilości białek RFLAT-1 i eIF4E w odpowiednich punktach czasowych i odkryliśmy, że nastąpił wzrost obu białek towarzyszących zwiększonej ekspresji RANTES (Figura 6, b i c). Co ciekawe, blot EIF4E wykazał wzrost głównie w postaci wolniejszej migracji i przypuszczalnie fosforylowanej. Tak więc ekspresja RANTES w komórkach T jest ściśle regulowana przez zmiany w środowisku komórkowym poprzez aktywację podstawowej maszyny translacyjnej. Figura 6IL-2 indukuje ekspresję RANTES i RFLAT-1. (a) Komórki T zależne od IL-2. stymulowano 1000. / ml rIL-2 i mierzono wewnątrzkomórkowe RANTES za pomocą FACS. Linia kropkowana, bez stymulacji; linia ciągła, 4 godziny po stymulacji. (b i c) Podwielokrotności komórek poddano lizie i poddano analizie Western blot przy użyciu przeciwciał anty-RFLAT-1, anty-EIF4E i anty-Hsc70. Wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. * P <0,05. Dyskusja RFLAT-1 jest głównym czynnikiem transkrypcyjnym, który pozytywnie reguluje ekspresję RANTES w aktywowanych komórkach T. Ekspresja białka RFLAT-1 jest regulowana rozwojowo, pojawiając się późno po aktywacji komórek T (20). W przeciwieństwie do tego, jego komunikat jest wszechobecny, a jego poziomy stanu ustalonego nie zmieniają się podczas aktywacji komórek T. Tutaj badaliśmy mechanizm molekularny leżący u podstaw potranskrypcyjnej kontroli ekspresji genu RFLAT-1. Regulacja ekspresji RFLAT-1 odbywa się za pośrednictwem jej 5 -UTR. RFUT-1 5 -UTR jest bardzo bogaty w GC i zawiera trzy alternatywne miejsca startowe dla krótkich uORF. Delecja 5 -UTR spowodowała znaczny wzrost wydajności translacji w teście transkrypcji-translacji in vitro. Ponadto, fuzja RFAT-1 5 (3 -UTR z regionem kodującym lucyferazy hamowała aktywność lucyferazy, zarówno w transfekowanych komórkach ssaków, jak iw testach translacji in vitro. Wskazuje to, że RFEC-5 5 -UTR jest nie tylko niezbędna, ale także wystarczająca do pośredniczenia w represji translacji. Co ciekawe, działanie 5 -UTR było bardziej wyraźne w komórkach T, co sugeruje, że regulacja RFLAT-1 jest specyficzna dla limfocytów T. Translacja może być regulowana przez różne elementy działające w układzie cis w obrębie 5 (3 -UTR, to znaczy kontekst miejsca startu, uORF, miejsca wiążące dla białek regulatorowych, polipirymidynowe kanały i wewnętrzne miejsca wejścia rybosomu (45, 46). Wiadomo, że uAUG hamują inicjację translacji, przypuszczalnie przez zakłócanie inicjacji w prawdziwym kodonie startowym (23). Mutacyjna analiza uAUG RFLAT-1 wykazała, że uAUG1 i uAUG2 są ważne dla translacyjnej represji RFLAT-1, ponieważ mutacje punktowe dwóch uAUG całkowicie wyeliminowały działanie hamujące 5 a -UTR. Co ciekawe, chociaż mutacja pierwszego AUG spowodowała nieznaczny wzrost wydajności translacji, mutacja drugiego miejsca startu dalej hamowała translację. Przyczyny tego efektu są niejasne, ale brak drugiego uORF może zakłócać ponowne zainicjowanie rybosomu w miejscu początkowej inicjacji translacji w dobrej wierze. Stabilne struktury drugorzędne w 5 -UTR mogą zakłócać skanowanie rybosomu do miejsca rozpoczęcia translacji (24). Niezwykle wysoka zawartość GC w RFLAT-1 5 -UTR pozwala na tworzenie wielu wewnętrznych pętli spinki do włosów, co wykazano w komputerowych prognozach struktury drugorzędowej (21) [podobne: dieta dukana przepisy faza 1, portius krosno godziny otwarcia, obliczanie zdolności kredytowej ] [hasła pokrewne: młody jęczmień green ways, niedobór witaminy d u dorosłych objawy, leczenie kanałowe białystok ]