Skip to content

Reostat translacyjny dla RFLAT-1 reguluje ekspresję RANTES w limfocytach T ad

1 miesiąc ago

646 words

Pełnowymiarową ORF lucyferazy pochodzącą z pGL2Basic ligowano do pcDNA 3.1 V5 His Topo (Invitrogen Corp., Carlsbad, Kalifornia, USA) w celu utworzenia pcDNA 3.1 Luc. Hybrydowy konstrukt zawierający 5a -UTR RFLAT-1 i gen lucyferazy wytworzono przez ligację amplifikowanego PCR 5a -UTR z pcDNA3.1 RFLAT-1 do pcDNA3.1 Luc. Następujące mutacje punktowe 5 -UTR wprowadzono metodą PCR: UUG1, A38U; UUG2, A155U; i UUG3, A319U. PCR użyto do usunięcia pierwszych 142 nukleotydów (a AUG2) i pierwszych 306 nukleotydów (A AUG3) 5 -UTR RFLAT-1. Integralność wszystkich konstruktów została zweryfikowana przez sekwencjonowanie. Ab i odczynniki. Abs otrzymano z następujących źródeł: anty-eIF4E (4E) (Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, USA); kinaza anty-p44 / 42 MAP (ERK-1/2), kinaza anty-fosfo-p44 / 42 MAP (Thr202 / Tyr204) (P-ERK-1/2) i anty-fosfo-4EBP (Ser65) Ab ( Cell Signaling Technologies, Beverly, Massachusetts, USA); anti. – aktyna (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, Nowy Jork, USA); Sprzężone z FITC RANTES Ab i jego kontrola izotypowa IgG2B (Caltag Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornia, USA) i anty-FLAG M2 (Sigma-Aldrich St. Louis, Missouri, USA). Ab anty-RFLAT-1 został wcześniej opisany (20). Rapamycin był prezentem od Wyeth-Ayerst Laboratories (Filadelfia, Pensylwania, USA). RIL-2 był prezentem od National Cancer Institute (NCI), oddziału zasobów biologicznych, NCI, Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland, USA. Inhibitory kinaz MAP SB203580, SB202474 i PD98058 zakupiono od Calbiochem-Novabiochem Corp. (San Diego, Kalifornia, USA). Izolacja i kultura komórek T. Ludzkie limfocyty krwi obwodowej (PBL) i komórki T zależne od IL-2. przygotowano zgodnie z opisem (28). PBL (2 x 106 / ml) stymulowane 5 ug / ml fitohemaglutyniny P (PHA-P) hodowano do 7 dni. Komórki zależne od IL-2 (106 / ml), hodowane w obecności 100 U / ml rIL-2, stymulowano 1000 U / ml rIL-2 przez okres do 6 godzin. Wewnątrzkomórkowe barwienie wykonano przy użyciu zestawu Cytofix / Cytoperm (PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA), a fluorescencję mierzono za pomocą FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA). CD8 + długotrwała cytotoksyczna linia komórkowa limfocytów T (28) (106 / ml), wstępnie traktowana 100 nM rapamycyną przez 30 minut w 37 ° C, była stymulowana 500 U / ml rIL-2 i hodowana w obecności rapamycyny dla 0, 2, 4 i 6 godzin. Przygotowanie polyribosomu. Spoczynkowe lub aktywowane PBL (2 x 107 / próbkę) inkubowano z cykloheksymidem o stężeniu 0,1 mg / ml przez 3 minuty w 37 ° C, po czym komórki zebrano i poddano lizie przez traktowanie detergentem. Ekstrakty cytoplazmatyczne nakładano na gradienty liniowe 10 ~ 50% liniowych sacharozy i wirowano przy 150 000 g przez 2 godziny 45 minut w 4 ° C w rotorze Beckman SW41. RNA z frakcji izolowano przez ekstrakcję izotiocyjanianu guanidyny i analizowano metodą Northern blot, stosując standardowe techniki. Sondę RFLAT-1 przygotowano przez znakowanie a-32P fragmentu BamHI-do-XhoI cDNA RFLAT-1. Analiza RNA. Lizaty komórek Jurkat T transfekowanych plazmidem Luc i plazmidem 5 -UTR Luc przygotowano stosując test ochrony rybonukleazy z lizatem Direct Protect (RPA, Ambion Inc., Austin, Texas, USA). RPA przeprowadzono z użyciem antysensownych sond RNA syntetyzowanych z fragmentu PCR lucyferazy odpowiadającego nukleotydom od 14 do 328 pGL2 podstawowego (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) i pTRI-beta-aktyny-ludzkiej (Ambion Inc.). Pełna ochrona transkryptu lucyferazy przez transkrypty lucyferazy dawała fragment 314-nukleotydowy, podczas gdy chroniony fragment aktyny zawierał 245 nukleotydów. Przejściowe transfekcje, translacja in vitro i testy lucyferazy. Linie komórkowe NIH 3T3, HEK 293, S2-6 i S2-6-4E transfekowano Lipofectin (Invitrogen Corp.), a komórki Jurkat T elektroporowano jak opisano (20). Nieradioaktywne reakcje lucyferazy przeprowadzono stosując system szybkiej transkrypcji TnT (Promega Corp.), zgodnie z protokołem producenta. Aktywność lucyferazy mierzono zgodnie z opisem (20). W testach transfekcji przejściowej konstrukty lucyferazy (po 5 .g każda) kotransfekowano pRLNULL (0,1 .g na transfekcję), a aktywność lucyferazy normalizowano do aktywności lucyferazy Renilla, aby uwzględnić różnice w wydajności transfekcji. Pełne lizaty komórek przygotowano stosując zmodyfikowany bufor RIPA (28). Dla analizy Western, 20 .g całkowitego białka z każdej próbki przeprowadzono na 10% SDS-PAGE. Analiza statystyczna. Wyniki wszystkich testów lucyferazy są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach
[więcej w: atopowe zapalenie skory zdjecia, chomik syryjski ile żyje, obliczanie zdolności kredytowej ]
[podobne: fit med salon, fitmed, fit med ]