Skip to content

Reostat translacyjny dla RFLAT-1 reguluje ekspresję RANTES w limfocytach T cd

2 miesiące ago

367 words

Istotność różnic między wartościami doświadczalnymi i kontrolnymi obliczono przy użyciu ANOVA. Obliczenia przeprowadzono za pomocą Microsoft Excel. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Wyniki Badania kinetyczne ekspresji RFLAT-1 w limfocytach T wykazały, że jego mRNA pozostaje stałe zarówno w komórkach spoczynkowych, jak i aktywowanych. Niemniej jednak białko RFLAT-1 ulega ekspresji tylko 3. 5 dni po aktywacji (20). W analizie Western blot z wieloma ludzkimi tkankami, badanej za pomocą przeciwciała anty-RFLAT-1, ujawniono, że białko RFLAT-1 występuje tylko w dojrzałej śledzionie i płucu, a nie w wątrobie, mózgu, nerce, sercu i narządach rozrodczych (dane nie pokazane), podczas gdy jego komunikat jest wszechobecny we wszystkich badanych tkankach (20). Ta obserwacja wskazuje, że ekspresja RFLAT-1 jest regulowana przez mechanizm potranskrypcji. MRNA RFLAT-1 aktywnie ulega translacji późno po aktywacji komórek T. Gradienty sacharozy wykorzystano do analizy połączenia mRNA RFLAT-1 z frakcjami polisomalnymi pochodzącymi z spoczynku (dzień 0) lub aktywowanego (dzień i dzień 5 po aktywacji mitogenem) PBL. Jak widać na rysunku 1, a i b, dramatyczne przesunięcie mRNA RFLAT-1 z monosomu (frakcja 4) i wczesnego polisomalu (frakcje 5 i 6) do późnych frakcji polisomalnych (do frakcji 9) obserwowano w dniu 5 w porównaniu z dniem po aktywacji komórek T, wskazując, że ekspresja RFLAT-1 jest regulowana translacyjnie. Figura 1RFLAT-1 5a -UTR hamuje translację in vitro i in vivo. (a) Profil absorbancji (254 nm) gradientów sacharozy z lizatów spoczynkowych (D0) lub aktywowanych PHA (D1 i D5) PBL. (b) Dziewięć frakcji zebrano z każdego gradientu i równe objętości każdej frakcji rozdzielono na żelu agarozowym i analizowano przez hybrydyzację Northern z sondą RFLAT-1. Rarna 18S i 28S w każdej frakcji wizualizowano za pomocą barwienia bromkiem etydyny. (c) Konstrukty ekspresyjne RFLAT-1. (pełnej długości [RF] lub bez 5a -UTR [a U]) poddano translacji transkrypcji in vitro w obecności 35S metioniny. Produkty wykryto przez autoradiografię. (d. g) pcDNA3.1 Luc (Luc) lub pcDNA 3.1 5 -UTR Luc (5 -UTR Luc) poddano translacji transkrypcji in vitro (d) lub przejściowo transfekowano do komórek T Jurkat (e i g) lub komórki HEK293 (f) i oznaczono aktywność lucyferazy. Dane przedstawiono jako względną aktywność lucyferazy, gdzie aktywność konstruktu 5 -UTR-Luc jest arbitralnie ustawiona na 1. * P <0,05 (d, e, i f). Zmniejszające się ilości lizatów z transfekowanych komórek Jurkat poddano RPA (g) przy użyciu lucyferazy (górny panel) i rybosonek aktyny (dolny panel). Ścieżki 2 i 5, 30. L; 3 i 6, 15. L; 4 i 7, 7,5 l lizatu. RFUT-1 5 (3 -UTR pośredniczy w regulacji translacji zarówno in vitro, jak i in vivo. Wydajność tłumaczenia może być modulowana przez 5. i 3. UTRs wiadomości (23). 5-JUTR RFLAT-1 jest niezwykle długi (360 nukleotydów) i ponad 80% bogaty w GC. Jego delecja spowodowała ponad 25-krotny wzrost białka RFLAT-1 w porównaniu z cDNA o pełnej długości (Figura 1c), demonstrując główną rolę 5-YUTR w regulacji translacyjnej RFLAT-1. W celu dalszej analizy roli 5 (3 -UTR, skonstruowano hybrydowy konstrukt zawierający RFAT-1 5 -UTR połączony z ORF lucyferazy. Ten konstrukt (5 -UTR Luc) wraz z kontrolnym plazmidem zawierającym gen lucyferazy (Luc) zastosowano w teście transkrypcji-translacji in vitro. Obecność 5. -UTR RFLAT-1 hamowała aktywność lucyferazy ponad dziesięciokrotnie (Figura 1d). W badaniach in vivo te same konstrukty transfekowano do różnych linii komórkowych, a wydajność translacyjną mierzono na podstawie aktywności lucyferazy. W liniach komórek T Jurkat (Figura 1e) i Hut78 (dane nie przedstawione), obecność 5a -UTR zahamowała ekspresję w przybliżeniu trzykrotnie, podczas gdy w linii komórkowej fibroblastów 3T3 (dane nie pokazane) i w linii komórkowej nerki HEK293. (Ryc. 1f) efekt był marginalny. Aby sprawdzić, czy różnice w aktywności lucyferazy nie są na poziomie mRNA lucyferazy, przeprowadziliśmy RPA. Oba konstrukty lucyferazy transfekowano do komórek Jurkat T, komórki lizowano 72 godziny po transfekcji i seryjne rozcieńczenia lizatów hybrydyzowano z antysensowną rybosoneczką lucyferazy. Jak pokazano na Figurze 1g, podobne ilości transkryptów lucyferazy wytworzono z wektorów ekspresyjnych Luc i 5 -UTR Luc, co potwierdza, że obserwowane hamowanie aktywności lucyferazy jest spowodowane mechanizmem translacyjnym. Podsumowując, dane te pokazują, że 5a -UTR RFLAT-1 uczestniczy w regulacji translacji ekspresji genów in vivo i że ten efekt jest specyficzny dla komórek T. Rola uORF RFLAT-1 w regulacji translacyjnej [patrz też: pomidory suszone przepis, fit med, podkład match perfection ] [patrz też: chomik syryjski ile żyje, portius krosno godziny otwarcia, odżywki na mase mięśniową ]