Skip to content

Reostat translacyjny dla RFLAT-1 reguluje ekspresję RANTES w limfocytach T czesc 4

2 tygodnie ago

717 words

UAUG i uORF mogą hamować translację, przypuszczalnie przez zakłócanie skanowania rybosomu do miejsca startu translacyjnego (29. 31). RFUT-1 5 (3 -UTR jest wysoce konserwatywny między człowiekiem a myszą (76% identyczności). Ludzka sekwencja zawiera trzy uORF (oznaczone uORF1, 2 i 3), każdy z odpowiednim kodonem start i stop (Figura 2, aib). Rysunek 2 Wpływ uORF na efektywność tłumaczenia RFLAT-1. (a) Dopasowanie sekwencji 5a -UTR ludzkiej i mysiej RFLAT-1. Pozycje uAUGs i pierwszej metioniny są przedstawione (zacienione okno). Podkreślono kodony stop dla każdego z trzech uORF. Wyczyść pola wskazują identyczne nukleotydy; linie przerywane, brakujące nukleotydy. (b) RFAT-1 5 -UTR uORFs, oznaczone 1, 2 i 3, są przedstawione schematycznie. (c i d) 5 -UTR Luc (typu dzikiego lub zmutowany) poddano translacji in vitro (c) lub przejściowo transfekowano komórki Jurkat T (d), jak na Figurze 1. Aby zbadać znaczenie uORF RFLAT-1, każdy uAUG był indywidualnie mutowany do UUG, kodonu, który nie jest rozpoznawany przez rybosom jako miejsce inicjacji translacji (Figura 2b). Trzy mutacje oznaczono odpowiednio UUG1, UUG2 i UUG3. Kombinacje mutacji (UUG1,2; UUG1,3; UUG2,3; UUG1,2,3) również zostały stworzone w celu oszacowania znaczenia każdego z uORF (rysunek 2b). Zmutowane konstrukty poddano transkrypcji / translacji in vitro jak powyżej (Figura 2c) lub testowano in vivo przez transfekcję w komórkach T Jurkat (Figura 2d). In vitro mutacja uAUG1 (UUG1) lub uAUG2 (UUG2) powodowała w przybliżeniu dwukrotny wzrost aktywności lucyferazy, wskazując na równe znaczenie obu uORF w regulacji translacji (Figura 2c). In vivo, mutacja UUG1 powodowała nieznaczny wzrost aktywności lucyferazy, podczas gdy mutacja UUG2 powodowała dalsze hamowanie translacji (Figura 2d). Jednak kombinacje mutacji miały dodatkowe działanie w łagodzeniu represji translacyjnych, co sugeruje, że oba uORF są zaangażowane w regulację translacji ekspresji RFLAT-1 (Figura 2, c i d). Mutacje punktowe we wszystkich trzech uORF nie całkowicie zniosły replikację translacyjną in vitro, co sugeruje, że in vitro struktura drugorzędowa 5 -UTR również odgrywa ważną rolę. Co więcej, delecja 5a -UTR poprzedzająca AUG2 (A AUG2) nie uwolniła represji translacji, podczas gdy delecja 306 nukleotydów poprzedzających uORF3 (A AUG3), która usuwa pierwsze dwa uORF i większość z 5. Struktura wtórna UTR spowodowała sześciokrotny wzrost aktywności lucyferazy (Figura 2c). To wzmocnienie jest znacznie wyższe w porównaniu z mutantem UUG1,2, w którym zachowana jest rozległa struktura drugorzędowa, podczas gdy uORF1 i uORF2 są nieobecne. Mutacje AUG2 i A AUG3 nie miały dodatkowego efektu in vivo (Figura 2d), co potwierdza powyższy wniosek. Zastosowaliśmy RPA jak powyżej w celu określenia poziomów transkrypcji lucyferazy wytwarzanych przez każdy ze zmutowanych konstruktów i stwierdzono, że były one podobne do tych wytwarzanych przez transfekowany wektor Luc (dane nie przedstawione). Podsumowując, dane te wskazują, że translacyjna represja ekspresji RFLAT-1 odbywa się za pośrednictwem jej 5a -UTR, a in vivo jest głównie wynikiem pierwszych dwóch uORF. In vitro uORF1 i uORF2 wydają się równie ważne, a dodatkowa represja jest spowodowana przez strukturę drugorzędową 5 -UTR. Nadekspresja eIF4E zwiększa poziomy białka RFLAT-1. U ssaków większość regulacji translacyjnych zachodzi na poziomie inicjacji translacji, gdzie kompleks eIF4F pośredniczy w rekrutacji rybosomów do mRNA (25). Najmniej obficie ze wszystkich czynników inicjujących, eIF4E uważa się za ograniczenie szybkości wiązania rybosomu z mRNA i główny cel regulacji (32, 33). Poziom białka eIF4E wzrasta podczas pierwszych 24 godzin aktywacji limfocytów T (34). Zaobserwowaliśmy około dwukrotny wzrost poziomów białka eIF4E późno w aktywacji komórek T poprzedzających lub współistniejących z pojawieniem się RFLAT-1 w komórce (ryc. 3, aib). Sugerowało to, że eIF4E może być ważny dla indukowania ekspresji białka RFLAT-1. Ponieważ replikacja translacyjna wielu wiadomości z wysoce strukturalnymi 5 -UTR została złagodzona przez nadekspresję eIF4E (35, 36), używaliśmy poprzednio opisanej linii komórkowej induko- wanej tetracykliną S2-6-4E (37) do testowania wpływu eIF4E na Wyrażenie RFLAT-1. Wektory ekspresyjne dla pełnej długości RFLAT-1 (oznaczonego RF) i dla skróconego cDNA RFLAT-1, który nie zawiera 5a -UTR (oznaczonego A U), transfekowano do S2-6-4E i jego linii rodzicielskiej S2-6. Nadekspresję eIF4E indukowano przez usunięcie tetracykliny (37), a ekspresję RFLAT-1 zmierzono 24 godziny później.
[przypisy: warta ubezpieczenie turystyczne, przepisy w diecie dukana, fitomed krem nawilżający tradycyjny ]
[więcej w: warta ubezpieczenie turystyczne, kotlety mielone bez jajka, sennik pocałunek w policzek ]