Skip to content

Zmniejszona miażdżyca w CX3CR1 / myszy ujawniają rolę fraktalkiny w aterogenezie ad

4 tygodnie ago

729 words

Wyznaczono również SMC poprzez wybarwienie włókien elastyny za pomocą barwienia Movat. Skrawki suszono na powietrzu przez godzinę, a następnie utrwalano w acetonie przez 10 minut w ~ 20 ° C lub w formalinie (10%) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W celu barwienia przeciwciał aktywność endogennej peroksydazy neutralizowano H2O2 (0,3% obj./obj.) Przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a sekcje blokowano za pomocą BSA (3% wag./obj. W PBS i 20 mM glicyny) przez 60 minut w pokoju. temperatura. Przeciwciała swoiste dla rodzaju komórki lub przeciwciała kontrolne inkubowano przez noc z wycinkami w rozcieńczeniu 1: 400 w PBS z 20 mM glicyny w temperaturze 4 ° C. Po płukaniu dodano kozie przeciwciało przeciw biocienylowanemu surowicy przeciw chomika (rozcieńczenie 1: 300, BD Pharmingen), a następnie peroksydazę chrzanową streptawidyny (BD Pharmingen). Sygnał został wzmocniony zestawem do amplifikacji sygnału tyramidowego (TSA) (NEL 702, NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA) zgodnie z protokołem producenta, a skrawki wybarwiono kontrastowo dla jąder z DAPI (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Dla (3-aktyny użyto zestawu MOM (Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA). FK wykryto kozim przeciwciałem anty-mysim FK (rozcieńczenie 1: 300, R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA), które zostało wytworzone przeciwko domenie N-końcowej mysiej FK i które nie reaguje krzyżowo z CD84 ( 15). Dodano biotynylowane drugorzędowe przeciwciało (rozcieńczenie 1: 300, BD Pharmingen), a następnie peroksydazę chrzanową streptawidyny (BD Pharmingen). Sygnał został wzmocniony zestawem TSA NEL 702 (NEN Life Science Products Inc.) zgodnie z protokołem producenta, z tetrametylorodaminą jako fluoroforem. Swoistość tego przeciwciała potwierdzono przez blokowanie barwienia rozpuszczalnym FK (R & D Systems Inc.). Kolokalizacja FK z komórkowymi komponentami zmian miażdżycowych. Kolokalizację FK z SMC, komórkami śródbłonka i makrofagami przeprowadzono na losowo wybranych odcinkach aorty zatokowej C57BL / 6 apoE A /. myszy utrzymywane na diecie zachodniej przez 10 lub 15 tygodni. Aby określić kolokalizację FK z makrofagami, zastosowano metodę podwójnego barwienia immunologicznego. Skrawki tkanek wybarwiono dla FK, jak opisano powyżej, co dało czerwoną fluorescencję. Do wykrywania makrofagów zastosowano kombinację trzech przeciwciał skoniugowanych z FITC (F4 / 80, CD68 i MOMA-2, Serotec Inc., Raleigh, North Carolina, USA), co dało początek zielonej fluorescencji. Obrazy przechwycone filtrem fikoerytryny (czerwony fluorofor) połączono z obrazami uchwyconymi za pomocą filtra FITC (zielony fluorofor); kolokalizacja FK i makrofagów była wskazywana przez otrzymany żółty kolor. Aby oznaczyć ilościowo kolokalizację monocytów / makrofagów CDllb + za pomocą FK, skrawki barwiono dla FK, jak opisano powyżej, i dla CDllb stosując przeciwciała skoniugowane z FITC z BD Pharmingen (klon M1 / 70) i Serotec Inc. (klon 5C6). Przebadano łącznie 300 pól o dużej mocy i zanotowano liczbę komórek CD11b + sąsiadujących z FK. Intensywność FK oceniano w skali. do +++. Rozcięcie tętnic, ustalenie pierwotnych hodowli komórek i przygotowanie RNA. Wszystkie procedury przeprowadzono w warunkach aseptycznych przy użyciu C57BL / 6 apoE A /. myszy, które były utrzymywane na diecie zachodniej przez 10 lub 15 tygodni. Pierwotne komórki śródbłonka zebrano przez otwarcie aorty piersiowej i brzusznej podłużnym nacięciem, umieszczenie spłaszczonego naczynia między dwoma szklanymi szkiełkami mikroskopowymi i delikatne naciśnięcie. Po usunięciu naczynia komórki śródbłonka pozostały przywarte do szkła, a RNA ekstrahowano przez dodanie roztworu Trizol. Barwienie przeciwciałami swoistymi wobec SMC-pektyny, CDllb i MOMA-2 potwierdziło, że te preparaty zawierały mniej niż 1% SMC i / lub makrofagów. Aby oznaczyć ilościowo ekspresję FK w SMC in vivo, pobraliśmy ośrodki aorty, jak opisał Schecter i in. (16). W skrócie, aortę piersiową izolowano i trawiono w HBSS zawierającym 175 U / ml kolagenazy typu II (Worthington Biochemical Corp., Lakewood, New Jersey, USA) przez 3-5 minut. Przydanki usunięto z podłoża aortalnego, chwytając obie tkanki kleszczami i delikatnie pociągając w przeciwnych kierunkach. Wszelkie pozostające luźno przylegające tkanki usunięto z podłoża aortalnego, delikatnie zeskrobując wygiętymi kleszczami. W celu ekstrakcji całkowitego RNA, ośrodek aortalny przepłukano DMEM, pocięto na małe kawałki, umieszczono w roztworze Trizol i szybko zamrożono. Aby ustalić hodowle SMC, preparaty środków aortalnych dalej trawiono świeżym roztworem HBSS zawierającym kolagenazę typu 175 U / ml typu II i elastazę 0,25 mg / ml (Sigma typu I z trzustki wieprzowej, Sigma-Aldrich, St., Louis, Missouri, USA), jak opisali Schecter i in
[hasła pokrewne: warta ubezpieczenie turystyczne, podkład match perfection, sennik pocałunek w policzek ]
[więcej w: fitmed, fit med, chomik syryjski ile żyje ]