Skip to content

Zmniejszona miażdżyca w CX3CR1 / myszy ujawniają rolę fraktalkiny w aterogenezie cd

2 miesiące ago

699 words

Pierwotne hodowle SMC hodowano w 20% FCS / DMEM przez pierwsze 48 godzin, a następnie 10% FCS / DMEM. Inkubacja pierwotnych hodowli przeciwciał specyficznych dla komórek śródbłonka (CD144 i MECA-32) i markerów monocytów / makrofagów (CD11b, CD68, F4 / 80 i MOMA-2) potwierdziła, że hodowle zawierały mniej niż 1% komórek śródbłonka i / lub makrofagi, odpowiednio. Aby ocenić ekspresję FK w korzeniu aorty, usunięto serce i przytwierdzoną aortę, wycięto korzenie aorty i ostrożnie usunięto pozostałą tkankę mięśnia sercowego przy użyciu stereoskopowego mikroskopu. Następnie tkankę korzenia aorty pocięto na małe kawałki, umieszczono w roztworze Trizol i szybko zamrożono. Makrofagi pochodzące z szpiku kostnego wyizolowano w sposób opisany przez Fortiera i in. i Kruisbeek i in. (17, 18) i hodowano w DMEM uzupełnionym 20% FBS, 2 mM L-glutaminą, mM pirogronianem sodu, 2 mM penicyliną / streptomycyną i 30% L929 komórkowym kondycjonowanym podłożem. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego analizowano po 8 dniach w hodowli, w którym to czasie uzyskano makrofagi-podobną morfologię i były one ponad 99% dodatnie pod względem powierzchniowej ekspresji MOMA-2, F4 / 80 i CD68. Analiza ekspresji genów za pomocą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym. Całkowity RNA wyekstrahowano za pomocą metody opartej na fenolu / chloroformie (odczynnik TRIzol, Invitrogen Corp., Carlsbad, Kalifornia, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. Aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenie genomowym DNA, próbki RNA traktowano DNazą (bez DNA 4 U, Ambion Inc., Houston, Texas, USA) w obecności inhibitora RNazy (RNaseOut; Invitrogen Corp.) w 37 ° C przez godzinę. . RNA następnie oczyszczono dalej stosując mini kolumny RNeasy (QIAGEN Inc., Los Angeles, Kalifornia, USA), a stężenie określono przy użyciu czułego testu wiązania barwnika kwasu nukleinowego (RiboGreen, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) zgodnie z zgodnie z instrukcjami producenta. Ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym został wykorzystany do ilościowego oznaczenia poziomów mRNA FK w homogenizowanych próbkach tkanek mysich (przyśrodkowe SMC, korzenie aorty i śródbłonek) oraz w hodowanych komórkach mysich (SMC i makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego). Całkowity RNA (200 ng) poddano odwrotnej transkrypcji w 40-. L reakcji zawierającej oligo (dT) 12. 18 starter i enzym SuperScript II (Invitrogen Corp.). Komplementarny DNA poddano analizie ilościowej pod kątem ekspresji mysiego FK w fluorogennym teście PCR z p-nukleazą przy użyciu ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Konkretne sondy starterowe dla mysiego FK otrzymano z Applied Biosystems. W skrócie, 5. L cDNA (25 ng) amplifikowano w obecności 12,5. L TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), sondy i starterów specyficznych dla 1,25. L i 6,25. L wody. Próbki poddano następującym protokołom PCR: 50 ° C przez 2 minuty; 95 ° C przez 10 minut; i 40 cykli w 95 ° C przez 15 sekund, a następnie w 60 ° C przez minutę. Względne poziomy ekspresji zostały obliczone za pomocą metody porównywalnego progu cyklu, jak podano w biuletynie technicznym producenta. Zmierzone poziomy RNA znormalizowano do a-glukuronidazy (a-GUS) i wyrażono jako stosunek mysiego FK / y-GUS. Sekwencje par primerów dla a-GUS były 5 (3-CTCATCTGGAATTTCGCCGA-3. (forward) i 5. -GGCGAGTGAAGATCCCCTTC-3. (rewers). Syntezę master SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, Wielka Brytania) zastosowano do detekcji cDNA a-GUS. Analiza szybkiej chromatografii cieczowej i analiza lipidów. Myszy utrzymywano na diecie zachodniej przez 5 tygodni lub 10 tygodni. Lipoproteiny frakcjonowano za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC) na kolumnie Superose 6 (Amersham Biosciences, Newark, New Jersey, USA), jak opisano (19). W celu oznaczenia lipidów pobierano krew przez nakłucie serca od myszy w momencie uśmiercenia, po nocnym poście. Poziom cholesterolu w osoczu oznaczano za pomocą zestawu Boehringer Mannheim nr. 816302 (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Niemcy) i całkowite triglicerydy osocza oznaczono za pomocą testu kolorymetrycznego (Abbott nr 1352, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA) zgodnie z opisem producenta. Analiza statystyczna. Aby przeanalizować różnice w zakresie miażdżycy tętnic, pomiarów lipidów i masy ciała, przeprowadzono testy U Manna-Whitneya przy użyciu oprogramowania InStat 2.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornia, USA). Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Analiza miażdżycy. Stopień miażdżycy oceniano, określając rozmiary zmian zarówno w aorcie z otwartym wpustem, jak i seryjnych przekrojach poprzecznych przez korzeń aorty, jak opisano (20, 21).
[patrz też: sennik pocałunek w policzek, leczenie kanałowe białystok, fitomed krem nawilżający tradycyjny ]
[podobne: portius krosno godziny otwarcia, odżywki na mase mięśniową, jęczmień green ways ]